华重楼最早收载于《神农本草经》,是历版《中国药典》的基原植物,收载于2015年版《中国药典》一部中^[1]。十几年前重楼资源绝大多数为野生,由于生长年限较长,一般为6-8年,而市场需求量大,这在一定程度上刺激了农户过度采挖,导致野生资源日益稀少、供不应求,同时,近几年随着重楼市场价格暴涨,药材价格高达950-1250元/公斤,导致重楼成为了珍稀濒危贵重药材。近十年,为了缓解重楼野生资源的不足,人工规模化繁育和种植重楼的生产模式不断涌现,重楼由多种植物种共生状态变为纯植物种群状态,各类病菌在原生态中几乎很少发病或者是轻病,规模化种植后,许多重楼种植基地几乎年年都会遇到不可逆转的重病害,导致大面积重楼的根茎、花和果实腐烂,造成重楼果实和种子无收成、根茎当年无产量,造成巨大的直接或间接损失,严重影响了重楼人工种植品在市场上的竞争力。因此,安全有效的病害防治技术对保证重楼药材质量、促进重楼产业持续健康发展有重要意义。目前,有关重楼病虫害的防治研究报道大部分集中在国内,且数量非常有限,国外少有报道。本课题对西南民族大学汶川县水磨镇白石村一组重楼人工繁育基地,近些年频繁出现的华重楼病害进行了实地调查、样品采集,发现主要病害为叶斑病和软腐病,这两种病害极大地危害了基地重楼的生长、产量及质量。因此,本课题拟以华重楼的这2种病害为核心,对其进行病原菌分离鉴定、室内药剂筛选、田间药剂筛选;同时,比较华重楼植物病株和健康植株在显微、薄层,水分、灰分、浸出物、总皂苷含量、重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷含量水平上的差异,并对重楼病株和健康植株根茎的急性毒性、止血时间、凝血时间等方面开展了比较研究,以期寻找华重楼植物叶斑病、软腐病的生物防治方案,探讨其病害与质量的相关性。主要研究内容如下:（1）实地调查,采集华重楼叶斑病样品,采用“组织分离法”分离鉴定出了导致华重楼叶斑病的病原菌为细交链孢菌Alternaria tenuis Nees（sp.）,菌丝黄褐色至棕褐色。观察其孢子形态,发现孢子一端有芽管,孢子和菌丝上均有隔,且孢子数量较多。采用柯赫氏法则测定其致病性,接种8 d后发现华重楼健康叶片发病,叶片边缘出现水渍状斑点,棕褐色,后斑点逐渐扩大,斑点间连接成片状,同时叶片背部也出现斑点,与田间华重楼叶斑病发病现象相似。采集华重楼软腐病样品,采用“组织分离法”分离鉴定出导致华重楼软腐病的病原菌为葡萄孢属灰葡萄菌Botrytis cinerea Pers.。该菌气生菌丝为绒毛状,米黄色至浅褐色,其分生孢子外观呈葡萄穗状,单孢、椭圆形、无色或淡色。依照柯赫氏法则测定致病性,7 d后病菌扩展,病部出现腐烂症状,与田间发病症状一致。（2）针对华重楼叶斑病选用10%多抗霉素可湿性粉剂、80%乙蒜素乳油、3%中生菌素可湿性粉剂等6种常见的生物农药作为供试药剂,采用菌丝生长速率法测定6种药剂对华重楼叶斑病的毒力,试验结果表明:10%多抗霉素可湿性粉剂、68%宁南霉素水剂、80%乙蒜素乳油3种药剂抑菌效果较好,其EC₅₀值分别达到了0.283 mg/L、1.938 mg/L和2.804 mg/L。故选用这3种药剂进行田间药效试验筛选出10%多抗霉素可湿性粉剂对华重楼叶斑病的防效最高,防效为76.98%。结合室内毒力测定和田间药剂防效综合得出:10%多抗霉素可湿性粉剂可作为防治华重楼叶斑病的最佳药剂推广使用。针对华重楼软腐病选用10%多抗霉素可湿性粉剂、68%宁南霉素水剂、0.5%几丁聚糖水剂等10种供试药剂,采用菌丝生长速率法测定10种药剂对华重楼叶斑病的毒力,试验结果表明:10%多抗霉素可湿性粉剂、68%宁南霉素水剂、0.5%几丁聚糖水剂、2%春雷霉素水剂、3%中生菌素可湿性粉剂抑菌效果较好,EC₅₀值分别为1.738 mg/L、3.419 mg/L、25.126 mg/L、25.405 mg/L、29.436mg/L。故选用这几个药剂进行田间药效试验筛选出10%多抗霉素可湿性粉剂防效最高,防效为66.46%。综合得出10%多抗霉素可湿性粉剂可作为防治华重楼软腐病的最佳药剂。测定了田间试验期间的最高温度、最低温度、最高湿度、最低湿度、天气、雨量等气象应子。从测得数据得出,病害盛行期间整体雨量多、湿度大、气候潮湿。（3）根据2015版《中国药典》重楼药材质量标准中鉴别项和检查项下的规定,测定比较了病害与健康重楼显微、薄层和水分、灰分等差异。试验结果表明:1)病害与健康重楼粉末没有明显区别,二者均含有草酸钙针晶、草酸钙簇晶、梯纹导管、网纹导管、淀粉粒,这与2015版《中国药典》（一部）规定的重楼粉末鉴定结果一致。2)薄层色谱鉴别结果表明病害与健康重楼根、茎、叶与对照品重楼皂苷Ⅶ均在相应的位置上显示相同颜色的荧光斑点,说明病害与健康重楼均含有重楼皂苷Ⅶ。3)所测定的18个样品中,病害重楼水分含量在6.2%～9.05%之间,总灰分含量在3.35%～6.45%,酸不溶性灰分含量在0.28%～1.25%之间,生理灰分含量为2.21%～5.66%,浸出物含量为17.36%～34.88%;健康重楼中水分含量为6.83%～8.51%,总灰分含量为3.39%～6.59%,酸不溶性灰分含量为0.22%～1.21%,生理灰分含量为2.48%～6.25%,浸出物含量为14.57%～26.95%。方差分析结果表明:病害与健康重楼根、茎、叶在水分、灰分、醇溶性浸出物含量水平上无统计学差异,说明病害对重楼水分、生理灰分和醇溶性浸出物的含量影响非常小或者无影响;而病害与健康重楼叶的总灰分、酸不溶性成分间存在极显著的差异（n=9,P<0.01）。健康重楼叶总灰分含量小于病害重楼,而酸不溶性成分则相反。4)采用紫外分光光度法测定了华重楼健康植株与病害植株根、茎、叶总皂苷含量的变化,试验结果表明:病害重楼中总皂苷含量在0.14%～1.68%之间,健康重楼中总皂苷含量在0.35%～4.89%。方差分析结果表明:健康与病害重楼根,健康与病害重楼茎、健康与病害重楼叶之间在总皂苷含量上均存在极显著性差异（P<0.01）,说明重楼在受到病害影响后,总皂苷含量显著下降。5)采用红外指纹图谱比较了华重楼健康植与病害植株根、茎、叶特征吸收峰的不同。试验结果表明:重楼的主要活性成分甾体皂苷类在健康植株根S10有明显特征吸收峰,但病害植株根S1在相应位置则没有明显的特征吸收峰,说明病害植株中甾体皂苷含量有很大影响;病害重楼根S1在2942.64 cm^-1附近、病害重楼叶S7在2939.99 cm^-1附近有多糖、脂类等亚甲基C-H反对称伸缩振动吸收;而健康植株在相应位置则没有该吸收;说明病害引起了重楼植株中其他化学成分的改变;健康或者病害的华重楼各自的不同植物部位（根、茎和叶）的光谱特征也存在较大的差异,提示由于同一产地、同一植株的不同植物部位（根、茎和叶）化学成分组成和含量的不同。6)建立了UPLC-ELSD法测定华重楼健康与病害植株根、茎和叶中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷的含量,定量评价了华重楼病害植株和健康植株不同植物部位（根、茎和叶）中7种皂苷含量的差异。色谱条件为:ACQUITY UPLC?BEH C18色谱柱（2.1 mm×50mm,1.7μm）,ELSD检测器漂移管温度55℃,氮气压力40 psi,增益500,冷却模式,柱温30℃,流速0.2 m L·min^-1,进样量:3μL,流动相为乙腈（C）-水（D）,梯度洗脱程序为:0-3 min,10%→51%C;3-20 min,51%→80%C。病害重楼中重楼皂苷Ⅰ的含量在0.023%～0.283%,健康重楼含量在0.045%～0.248%之间。健康重楼和病害中重楼皂苷Ⅱ含量极低,大部分样品中均未检测到;重楼皂苷Ⅴ在健康与病害重楼中含量接近,在0.021%～0.186%之间;健康与病害重楼中重楼皂苷Ⅵ含量在0.011%～0.687%之间,两者含量相近;重楼皂苷Ⅶ和重楼皂苷H含量范围分别在0.118%～0.687%和0.009%～0.373%之间;纤细薯蓣皂苷含量范围在0.052%～0.195%,7种皂苷总含量在0.272%～1.542%之间。方差分析结果表明:健康与病害重楼根、健康与病害重楼茎中,薯蓣皂苷H含量差异显著（P<0.05）,两者含量大小趋势相反,其余6种皂苷及总皂苷含量在健康和病害重楼相同部位中差异不显著,说明病害发生对这些组分含量的变化影响不大。以不同重楼样品中水分含量（X1）、总灰分（X2）、酸不溶性灰分（X3）、生理灰分（X4）、浸出物（X5）、总皂苷（X6）、重楼皂苷Ⅰ（X7）、重楼皂苷Ⅱ（X8）、重楼皂苷Ⅴ（X9）、重楼皂苷Ⅵ（X10）、重楼皂苷Ⅶ（X11）、重楼皂苷H（X12）、纤细薯蓣皂苷（X13）、7种皂苷含量总和（X14）作为14个评价指标,采用SPSS19.0进行主成分分析和聚类分析,通过计算综合得分排名来综合评价病害与健康重楼之间的差异。以综合得分结果表明:健康重楼叶（S16、S17）、健康重楼茎（S13）、健康重楼根（S10、S11）,病害重楼茎（S4、S5、S6）、病害重楼叶（S7）排名在前9位,其余样品排名较靠后,可见病害与健康重楼间并无规律性的差异;按照《中国药典》规定的以重楼皂苷I、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ的总量评价了各样品的品质;两种评价方法的结果表明S16、S10和S11均排序在前,其余样品排序没有发现统一规律;系统聚类分析结果与主成分分析得到的综合评分结果一致,排名接近的样品聚为了一类。（4）通过测定健康与病害重楼的凝血、止血作用,评价了病害的发生对重楼止血、凝血作用的影响。采用纯净水稀释病害重楼根茎粉末,设置重楼高、中、低剂量组、云南白药组、生理盐水组,灌胃,测定病害重楼根茎粉末对小鼠的急性毒性和止血时间、APTT、PT值。急性毒性试验结果表明:与对照组比较,给药组小鼠未见明显异常,提示病害重楼药粉未对小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃造成损伤;试验用病害重楼药粉溶液高、中、低3种剂量组均能缩短小鼠出血时间,并且显著缩小小鼠PT、APTT（预试验）。采用病害与健康重楼提取物,设置重楼高、中、低剂量组、云南白药组、生理盐水组,灌胃,测定重楼提取物对大鼠止血时间及凝血四项,试验结果表明:病害重楼提取物高、中、低剂量组同样都能缩短大鼠出血时间（P<0.05）,其中病害重楼高剂量组止血效果最好;健康重楼提取物高、中、低剂量组均能明显缩短大鼠出血时间（P<0.01）,其中健康重楼高剂量组止血效果最好;健康重楼高剂量组的止血效果优于病害重楼高剂量组。总体来说,健康重楼提取物止血效果比病害重楼好;云南白药对照组和病害重楼提取液高、中、低剂量组及健康重楼提取液高、中、低剂量组均能明显缩短试验大鼠PT、APTT和TT,提高试验大鼠的FIB;健康与病害重楼均具有较强的凝血、止血作用,健康重楼强于病害重楼。（5）华重楼主要病害为叶斑病和软腐病,一方面,病害的发生改变了华重楼的正常生长状态,长期的病害胁迫大大降低了重楼的产量,严重情况下甚至出现绝收的境地,给农户造成了不可估量的损失;另外一方面,凝血、止血是重楼主要功效之一的,病害显著降低了有效成分甾体皂苷的种类和含量,从而直接影响了药材的品质,其凝血、止血作用显著降低;势必影响临床疗效;同时,病害药材往往也混入市场,同等入药,不能完全发挥其药效,对于药材本身而言,也是一种浪费。因此,及时有效地采用生物多样性和少量低度农药防治华重楼病害,不仅可以将损失减小到最小,也是从源头保证华重楼药材品质的关键措施,缓解华重楼药材资源短缺的现状。