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皮肤恶性黑素瘤是恶性程度较高的肿瘤之一，易于侵袭和转移。近年来发现，BRAF基因在人黑素瘤中存在高频率的突变，目前对其在黑素瘤形成、侵袭和转移中的作用尚不完全明确。本课题的目的是通过质粒介导的RNA干扰技术来研究BRAF突变基因在黑素瘤发展、侵袭和转移中的作用。首先，用脂质体转染试剂将3条构建并鉴定好的质粒载体(braf1、braf2和neg，其中braf1和braf2分别特异性针对人黑素瘤BRAFV600E突变基因和BRAF基因，neg为阴性对照)转入黑素瘤细胞系A375细胞，并用含G418的培养液筛选阳性克隆。然后采用半定量RT-PCR和Westernblotting检测shRNA对BRAF基因的抑制作用。发现两个特异性质粒不同程度抑制BRAF基因的mRNA和蛋白的表达，其中以braf1的干扰效果最为明显，蛋白表达量下降90％。第二，我们将等量转入质粒（braf1和neg）及未转入质粒的肿瘤细胞，分别注入裸鼠皮下，观察干扰BRAFV600E后，肿瘤细胞的成瘤情况，结果显示braf1质粒组肿瘤较其它组生长缓慢，瘤体重量较轻。在另一个动物实验中，我们将质粒和转染试剂直接注射到动物模型的瘤体内，观察干扰BRAFV600E基因对肿瘤生长的抑制情况。结果显示braf1质粒在一定时间内能抑制肿瘤生长，抑瘤率为62％。第三，我们同样用半定量RT-PCR和Westernblotting检测了瘤体内的BRAF基因的表达，发现braf1质粒抑制了BRAF基因的mRNA和蛋白的表达，其中蛋白表达量下降62％。第四，我们用半定量RT-PCR和Westernblotting检测了体内外肿瘤细胞BRAF突变基因被干扰前后，MMP-2和VEGF的表达，并用酶谱法测定了MMP-2的活性，结果显示MMP-2和VEGF的表达在体内外有不同程度的减少，其中体外降低程度较体内明显。最后，我们用裸鼠和Transwell小室分别构建体内外的肿瘤侵袭模型，检测BRAFV600E突变基因在肿瘤侵袭中的作用，结果发现braf1质粒组肿瘤细胞穿过metrigel的数目减少，其在体内形成的肺转移灶也是减少的。以上结果说明，BRAFV600E突变基因可以促进人黑素瘤细胞生长和增殖，可以使肿瘤细胞分泌更多的MMPs和VEGF，增强肿瘤细胞侵袭和血管形成的能力，提高其转移的能力，提示BRAFV600E突变在黑素瘤生长、侵袭和转移中有重要作用，而以其为靶点的基因治疗可以抑制实验性黑素瘤的生长。