【摘 要】
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目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对肾小管上皮细胞免疫调节作用的影响及TLR4在其中的作用。方法:（1）选取6周龄C57BL/6J-TgN转基因小鼠适应性喂养一周后随机分为实验组、干预组,另取C57BL/6J小鼠作为正常对照组,干预组于小鼠第8周龄尾静脉注射TLR4 shRNA慢病毒,每4周注射一次。分别于第8、12、16、20、24周龄采集小鼠血液、尿液标本,于第24周龄处死小鼠,观察小鼠肾
【基金项目】
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国家自然科学基金（81170672;81200527）；
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目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对肾小管上皮细胞免疫调节作用的影响及TLR4在其中的作用。方法:（1）选取6周龄C57BL/6J-TgN转基因小鼠适应性喂养一周后随机分为实验组、干预组,另取C57BL/6J小鼠作为正常对照组,干预组于小鼠第8周龄尾静脉注射TLR4 shRNA慢病毒,每4周注射一次。分别于第8、12、16、20、24周龄采集小鼠血液、尿液标本,于第24周龄处死小鼠,观察小鼠肾功能及肾组织病理变化,并采用免疫组化及免疫荧光观察肾组织HBx、TLR4表达,巨噬细胞、T细胞浸润情况及肾小管上皮细胞免疫分子表达情况。（2）构建pcDNA3.1-myc-HBx过表达质粒及TLR4 shRNA质粒,转染人近端肾小管上皮细胞系（HK-2）,Western blot检测HBx、TLR4的表达,流式细胞术观察HK-2细胞MHC-II、CD40表达;混合淋巴细胞反应（MLR）检测共培养后流式细胞术检测CD4+T细胞CD40L的表达及CD4+T细胞增殖的能力;ELISA测定MLR上清中IFN-γ、IL-4含量;用上述HK-2细胞的培养上清去刺激巨噬细胞,检测巨噬细胞粘附性,ELISA及Real-time PCR检测MCP-1、TNF-α、IL-1β表达。（3）采用Western blot检测HK-2细胞TLR4下游信号通路MyD88、IRAK4、TRAF6、TRAM、TRIF、IRF3、p-IRF3的表达,激光共聚焦检测p-IRF3、NF-κB p65的定位,ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-6表达及IFN-β表达;经MyD88抑制剂干预后,检测HK-2细胞MHC-II、CD40表达的变化。结果:（1）和对照组相比,C57BL/6J-TgN转基因小鼠自16周龄起24 h尿蛋白增加,第24周龄血肌酐显著增加,肾功能恶化,肾小球肾小管均有不同程度损伤。肾小管上皮细胞可见HBx及TLR4的表达,肾小管间质T细胞及巨噬细胞浸润明显,且肾小管上皮细胞MHC-II、CD40表达上调,浸润的T细胞CD40L表达增加;经TLR4 shRNA干预后,尿蛋白减少,肾功能缓解,肾小管上皮细胞TLR4表达降低,浸润的T细胞及巨噬细胞减少,且肾小管上皮细胞MHC-II、CD40的表达及浸润的T细胞CD40L表达都有所降低。（2）转染HBx基因的HK-2细胞TLR4、MHC II、CD40表达均上调,体外刺激T细胞增殖能力增强,T细胞CD40L表达增加,且T细胞分泌的IFN-γ/IL-4比值增高,体外刺激巨噬细胞活化,粘附性增强,分泌趋化因子MCP-1及炎症因子TNF-α、IL-1β增加;经TLR4shRNA干预后,HK-2细胞TLR4、MHC-II、CD40表达均下调,且刺激T细胞增殖能力减弱,T细胞CD40L水平下降,IFN-γ/IL-4比值下降,刺激巨噬细胞活化能力亦减弱,巨噬细胞粘附性降低,分泌趋化因子MCP-1及炎症因子TNF-α、IL-1β减少。（3）转染HBx基因的HK-2细胞中TLR4下游MyD88依赖信号通路分子MyD88、IRAK4、TRAF6表达均增加,NF-κB p65入核亦增加,炎症因子TNF-α、IL-6表达增加;非MyD88依赖信号通路分子TRAM、TRIF、IRF3、p-IRF3的表达亦增加,p-IRF3入核,IFN-β表达增加。使用MyD88抑制剂抑制MyD88信号通路后,HK-2细胞MHC-II、CD40表达均明显下调。结论:HBx可促进肾小管上皮细胞MHC-II及共刺激分子表达,发挥抗原提呈细胞样功能,进一步促进T细胞的激活、分化,并促进巨噬细胞活化,可能由此参与乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBV-GN）局部组织炎症免疫反应,促进HBV-GN的发展;TLR4在HBx介导肾小管上皮细胞免疫调节,发挥抗原提呈细胞样功能过程中发挥重要作用,抑制TLR4可抑制肾小管上皮细胞免疫功能,并产生防治效应;TLR4参与上一过程可能与其下游MyD88依赖信号途径激活有关。
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