绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)GP72是一株从青椒根际分离得到的植物根际促生菌株,它能够分泌吩嗪-1-羧酸(PCA)、2-羟基-吩嗪-1-羧酸(2-OH-PCA)、2-羟基-吩嗪(2-OH-PHZ)三种具有抗真菌作用的吩嗪类化合物,其中PCA与2-OH-PHZ均是有效的杀菌剂。PCA由于其广谱而良好的抗菌效果和环境友好等特点,在2011年被中国农业部授予农药证书,并将其正式命名为“申嗪霉素”。相对于PCA,2-OH-PHZ在拮抗某些病菌时显示出更好的效果,如防治引起小麦全蚀病的病源真菌。小麦全蚀病是一种严重影响小麦产量的全球性病害,目前尚没有特效农药,2-OH-PHZ则是很好的潜在候选,具有良好的应用前景。由于吩嗪类物质的化学合成产量不高,并产生氧化铅、苯胺、苯二胺等有毒有害物质,阻碍了其生产应用,因此利用微生物发酵生产以PCA、2-OH-PHZ为代表的吩嗪类物质是一个必选方案。目前,利用微生物发酵生产2-OH-PHZ的菌株主要来自绿针假单胞菌,GP72便是其中一株,但其野生株的2-OH-PHZ产量仅仅只有4.5 mg/L。因此提高GP72菌株中2-OH-PHZ的产量成为我们目前迫切需要完成的任务。为了提高绿针假单胞菌GP72中2-OH-PHZ的产量,我们采取了敲除负调控基因;增强吩嗪合成的前体途径-莽草酸途径;删除吩嗪合成的竞争途径;优化phzO基因的密码子提高PCA转化2-OH-PHZ的效率等措施,虽然后两种尝试没有得到理想结果。首先,我们通过敲除负调控基因的方法提高GP72中2-OH-PHZ的产量。GP72中吩嗪类物质的合成是以分支酸为前体的,而分支酸的合成则是由4-磷酸-赤藓糖(E4P)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)经由莽草酸途径合成的。PEP作为中心代谢重要的中间产物,参与了一系列代谢反应,其中由丙酮酸激酶催化的PEP转化为丙酮酸的反应是重要的PEP消耗反应,阻断这一反应可以增强莽草酸途径。因此我们尝试将GP72中的丙酮酸激酶基因pykF敲除从而部分阻断PEP向丙酮酸的转化(GP72中含有pykA与pykF两个丙酮酸激酶合成基因),经过HPLC检测,pykF敲除株的2-OH-PHZ的产量相对于野生株GP72增长了6.7倍,由4.5 mg/L增加到35 mg/L。在实验室的前期研究中,我们通过插入失活负调控因子rpeA的方法大大提高了2-OH-PHZ的产量。我们在GP72Δpyk的基础上敲除了基因rpeA,获得了突变株GP72ND-1,经HPLC检测发现,2-OH-PHZ的产量由35 mg/L增长到239.8 mg/L。经研究发现负调控因子RpeA是双元调控系统RpeA/RpeB的组成部分,双元调控系统是细菌中重要的全局调控系统,而在假单胞菌中被研究最多的双元调控系统则是GacS/GacA系统。最近的研究表明,在绿针假单胞菌30-84中,通过GacS/GacA发挥作用的rsmE的过表达抑制了包括吩嗪在内的某些次级代谢产物的产生,因此我们在GP72ND-1菌株中敲除了rsmE基因获得了菌株GP72ND-2,2-OH-PHZ产量由239.8 mg/L提高到273.5 mg/L。同样的,有报道表明,在Pseudomonas protegens中,ATP依赖的蛋白水解酶LON可以通过降低GacA蛋白的稳定性来影响GacS/GacA的稳定性,在Pseudomonas protegens中敲除lon可以提高某些抗生素的活性,因此我们在菌株GP72ND-2上敲除了lon获得了菌株GP72ND-3,经检测发现菌株的2-OH-PHZ产量由273.5 mg/L上升到300.5 mg/L。我们通过在GP72基因组中连续敲除了pykF、rpeA、rsmE、lon四个基因使GP72的2-OH-PHZ的产量由4.5 mg/L提升到300.5mg/L。其次,为了增强GP72中2-OH-PHZ的产量,我们选择强化吩嗪合成底物-分支酸的合成途径--莽草酸途径。莽草酸途径的强化大致有以下几个策略:增加强化合成底物E4P与PEP,通过过表达转酮酶(由tktA编码),磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(由ppsA编码);解除或减轻限制途径或反馈抑制,如大肠杆菌中通常会通过点突变改造DHAP合成酶基因(由aroG、aroF、aroH等基因等编码,在假单胞菌中则是主要由phzC等基因编码);增强限制途径的催化酶的活性,如过表达DHQ合成酶(由aroB编码)、DHQ脱水酶(由aroD编码)、莽草酸脱氢酶(由aroE编码)等。我们选取了GP72中存在的ppsA、tktA、phzC、aroB、aroD和aroE六个莽草酸途径关键酶,利用模块化质粒pBbB5K在菌株GP72ND-3中进行过表达,而六个基因的排列顺序则与他们在反应途径中的顺序相反,菌株2-OH-PHZ的产量由300.5 mg/L上升到了450.4 mg/L。同时菌株的吩嗪类物质(包括PCA、2-OH-PHZ、2-OH-PCA)的总产量也达到了1520 mg/L。此外,我们通过删除吩嗪合成途径的竞争途径,优化吩嗪修饰酶PhzO等方法试图提高菌株2-OH-PHZ的产量。在GP72中,以分支酸为底物的合成途径不仅仅只有吩嗪合成途径一条,至少还包括叶酸合成途径、色氨酸合成途径、辅酶Q合成途径、酪氨酸与苯丙氨酸合成途径等,因此我们通过敲除GP72中的对氨基苯甲酸合成酶基因pabB/pabC、分支酸-苯丙酸裂合酶合成基因ubiC、邻氨基苯甲酸合成酶基因trpE、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶合成基因pheA等来阻断吩嗪合成的竞争途径,但遗憾的是基因敲除后严重影响菌株的生长。先前研究发现在GP72中吩嗪合成途径首先合成PCA,PCA在修饰酶PhzO的催化下形成2-OH-PCA,2-OH-PCA再自发脱羧形成2-OH-PHZ。PCA、2-OH-PCA、2-OH-PHZ三种吩嗪类化合物中以PCA为主,说明PhzO的转化效率并不高,而且经分析发现,phzO基因中存在大量的稀有密码子。为了获得高产量的2-OH-PHZ,我们按照GP72密码子的使用情况对phzO基因进行密码子优化,获得了优化基因phzO~O将其置换进GP72,经检测发现替换菌株的2-OH-PHZ产量并没有提高,说明稀有密码子并非PhzO催化效率低下的原因。本论文首先通过在GP72基因组中连续敲除了pykF、rpeA、rsmE、lon四个具有负调控作用的基因,使2-OH-PHZ的产量提高了60多倍,达到300.5 mg/L,接着通过过表达ppsA、tktA、phzC、aroB、aroD和aroE等六个莽草酸途径相关基因来强化莽草酸途径,最终获得了一株2-OH-PHZ产量为450.4 mg/L,吩嗪类物质总产量为1520 mg/L的突变株,为吩嗪类物质的工业化生产与农业上推广应用打下了坚定基础。