MY06在肝癌细胞增殖及侵袭转移中的作用及机制研究

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目的:肝癌的恶性程度高,预后差,目前尚无令人满意的的治疗手段。肝癌病因未明,但可以肯定的是其发生、发展是一个多基因、多步骤的复杂过程。随着生物技术的发展,如RNA干扰技术,基因编辑技术等,使从基因水平治疗肝癌成为可能。因此,找到在肝癌的增殖、侵袭转移过程中发挥重要作用的靶基因,通过针对性地修复、置换致病基因或纠正异常基因的表达调控,可以达到对肝癌的治疗作用。肌球蛋白VI(MY06)是其家族中唯一一个向微丝负极移动的蛋白,能水解ATP酶产生能量推动肌动蛋白丝的运动,是细胞的马达蛋白,能为细胞的迁移提供动力,参与吞饮或吞噬泡的运输,负责将高尔基体的分泌泡运输到胞内适当的位置,故有动力马达之美称。有报道称MY06在卵巢癌、前列腺癌及肾癌等恶性肿瘤中高表达,而且抑制MY06的表达能有效减少肿瘤的扩散和转移。我们的预实验已经证明MY06在肝癌组织中高表达,提示MY06在肝癌的发生、发展中可能扮演着重要角色。本次实验,我们希望通过增加样本量,进一步观察MY06在肝癌组织中的蛋白表达情况,明确MY06在肝癌增殖及侵袭转移中的作用,并初步探讨其可能的内在机制,为肝癌的靶向基因治疗提供理论依据。方法:我们的研究内容分为三个部分。1、通过免疫组化的方法,对比肝癌组织及正常肝组织中MY06的表达情况,明确MY06与肝癌发生发展的相关性。2、进一步明确干扰MYO6表达在肝癌细胞增殖中的作用并探讨其机制。2.1我们采用慢病毒(LV-MYO6 shRNA-GFP)感染筛选出的HepG2及SMMC7721肝癌细胞,通过荧光显微镜检测GFP绿色荧光,观察两种肝癌细胞的慢病毒感染效率,为进一步确定MYO6的干扰情况,我们通过real-time PCR及Western blot分别检测慢病毒感染HepG2及SMMC7721后MYO6 mRNA及蛋白表达水平。2.2我们通过MTT实验、克隆形成实验和Brdu掺入实验确定干扰MY06后肝癌细胞的增殖情况。2.3分别观察了干扰MY06表达后肝癌细胞的凋亡、自噬及细胞周期的改变。具体为:通过流式细胞技术检测干扰myo6表达后hepg2肝癌细胞凋亡水平的变化;通过westernblot及细胞免疫荧光检测干扰my06表达对细胞自噬的影响;通过流式细胞术分析干扰my06表达后hepg2细胞的细胞周期分布。2.4我们采用细胞内信号通路检测试剂盒结合westernblot技术检测所涉及凋亡、自噬和细胞周期改变信号通路的关键蛋白,初步探讨其发生机制及信号通路。3、我们采用transwell小室检测细胞侵袭转移能力并通过westernblot技术检测侵袭转移相关蛋白的表达变化,从而研究了干扰my06表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响及其机制。结果:1、通过免疫组化得出结果:与正常肝组织相比,肝癌组织中myo6的表达显著高于正常肝组织。2、干扰my06的表达,抑制了肝癌的增殖能力。其机制可能涉及激活p38-mapk通路和降低pras40磷酸化水平共同作用抑制肝癌增殖,其中通过激活p38-mapk通路促进肝癌细胞凋亡和降低pras40磷酸化水平抑制细胞自噬可能起重要作用。2.1慢病毒(lv-myo6shrna-gfp)感染hepg2及smmc7721肝癌细胞(moi=10)的感染率均超过了80%,感染后my06mrna和蛋白的表达都有明显下降。2.2mtt实验、克隆形成实验及brdu掺入实验结果示:干扰myo6表达后明显降低hepg2及smmc7721肝癌细胞增殖并抑制肝癌细胞dna合成。2.3流式细胞技术检测干扰myo6表达后hepg2肝癌细胞凋亡水平的变化,实验结果显示:凋亡明显增加;采用westernbolt技术检测自噬相关蛋白,结果显示:干扰myo6表达显著上调自噬底物p62的表达水平,同时干扰myo6后lc3i向lc3ii转化明显减少,细胞免疫荧光得到类似结果,进一步验证了干扰myo6表达抑制肝癌细胞自噬水平;为了探讨干扰myo6对肝癌细胞细胞周期的影响,我们在hepg2肝癌细胞转染myo6shrna四天后,通过流式细胞术分析hepg2细胞的细胞周期分布。结果显示:干扰myo6表达后g0/g1期和g2/m期的细胞的百分数相应增加,而s期细胞比例降低。2.4为了分析干扰my06的表达抑制肝癌细胞增殖能力的机制,我们采用了细胞内信号通路检测试剂盒结合westernblot的检测方法,发现在相关的信号通路中p38-mapk通路被激活,而pras40的磷酸化水平被抑制。据此,我们推测其机制可能涉及激活p38-mapk通路和降低pras40磷酸化水平共同作用抑制肝癌增殖,其中通过激活p38-MAPK通路促进肝癌细胞凋亡和降低PRAS40磷酸化水平抑制细胞自噬可能起重要作用。3、干扰MY06抑制肝癌细胞的侵袭转移能力,可能与抑制上皮间质转化有关。3.1我们采用Transwell侵袭实验进行研究,结果显示:干扰MYO6表达后细胞透膜数明显减少,提示肝癌的侵袭转移能力下降3.2为了进一步探讨其机制,我们采用Western blot技术检测侵袭转移相关蛋白的表达变化。结果显示:干扰MYO6表达后肝癌细胞E-cadherin表达明显上调,而Vimentin表达下调。说明干扰MYO6表达可能通过抑制上皮间质转化来抑制肝癌细胞侵袭转移能力。结论:MYO6在肝癌组织中高表达,干扰MYO6表达抑制了肝癌细胞增殖。其机制可以从肝癌细胞的凋亡、自噬和细胞周期变化三个方面考虑。其信号通路可能涉及通过激活p38-MAPK通路和下调PRAS40磷酸化水平抑制细胞增殖。其中,通过激活p38-MAPK通路促进肝癌细胞凋亡和降低PRAS40磷酸化水平抑制细胞自噬可能起重要作用。此外,我们研究发现干扰MYO6表达通过抑制肝癌细胞上皮间质转化来抑制肝癌细胞侵袭转移能力。本研究结果通过体外实验阐述了MYO6在肝癌增殖以及侵袭转移中的作用及相关机制,需要进一步通过体内实验研究去证实MYO6的作用,以期为肝癌的基因靶向治疗提供理论依据。
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