[研究背景及目的]暴发型肝衰竭(fulminant hepatic failure, FHF)是一种以肝损伤和功能障碍为主的临床疾病,起病急、病情危重、症状及并发症表现多样,死亡率高。暴发型肝衰竭的发病率和病因因地理区域的不同而异。病毒性肝炎及药物或毒素的摄入是其最常见的病因,全身免疫系统的激活是其最重要的病因。自然杀伤(NK)细胞在乙肝病毒感染导致的肝衰竭的发病机制中发挥了重要的作用。NK细胞作为天然免疫重要的效应细胞之一,是抗病毒感染的第一道防线。CD69属于外源凝集素的C-型超家族,它作为NK细胞活化的触发分子,同时也是NK细胞早期表达的细胞表面的活化标志。在病毒感染中,猕猴NK细胞的细胞毒活性被证实与CD69的表达相关。有研究表明,CD69的上调与NK细胞的细胞毒性和IFN-γ的产生相关。在我们前期研究中,发现MHV-3感染Balb/cJ小鼠后,肝损伤的严重程度与肝脏NK细胞的活化有关,但肝脏CD69+NK细胞在病毒诱导的暴发型肝衰竭中的作用及其机制研究则较少。在本研究中,我们将进一步研究肝脏CD69+NK细胞在MHV-3诱导的暴发型肝衰竭中的作用。同时,在前期研究中我们发现,在MHV-3介导的小鼠暴发性肝炎模型中,肝脏NK细胞的比例和数量显著增加,在感染48h达到峰值,随后至小鼠死亡仍保持着较高比例,相反在脾脏和骨髓,NK细胞比例和数量在感染后均显著减少。尽管外周血NK细胞的比例在感染后显著增加,但其数量却显著减少,表明MHV-3感染后,NK细胞从脾脏,骨髓和外周血迁移募集至肝脏。然而,在此过程中NK细胞趋化募集的机制仍不明确。在实验前期,我们利用基因芯片技术,筛选出具有差异表达的肝脏NK细胞趋化因子受体CCR5、CCR1、CXCR3以及CXCR4.而后,在MHV-3诱导的暴发型肝衰竭小鼠模型中,我们检测了肝脏NK细胞表面趋化受体CCR5、CCR1、 CXCR3和CXCR4的mRNA的表达水平随感染时间的动态变化。综合前期基因芯片结果,肝脏NK细胞表面趋化因子受体CCR5较其余三种受体在本模型中的mRNA表达水平发生了更为显著及平稳的变化。因此为了进一步深入研究肝脏NK细胞在病毒诱导的暴发型肝衰竭模型中的募集机制,我们对小鼠病毒性肝炎发病过程中趋化因子受体CCR5对NK细胞的趋化机制进行了初步探讨。CCR5是趋化因子受体G-蛋白偶联受体超家族的子类成员,广泛表达于NKT细胞,CD4+T细胞,巨噬细胞,NK细胞等多种细胞。它主要包含三个趋化因子配体：MIP-1α, MIP-1β和RANTES,也被称为CCL-3, CCL-4和CCL-5,与之共同调节免疫反应。大量的研究表明CCR5在多种肝脏疾病中发挥重要的作用：在暴发型肝衰竭患者的肝组织活检中,肝脏CCR5配体(MIP-1α, MIP-1β和RANTES)的表达量增加,但CCR5及其配体对在暴发型肝衰竭中的作用机制仍不明确。在本研究中,我们发现CCR5在MHV-3导致的暴发型肝衰竭中可能通过趋化募集外周NK细胞至肝脏,从而引起肝细胞坏死及继发性肝损伤。因此,本研究的目的如下：(1)肝脏CD69+NK细胞在MHV-3诱导的暴发型肝衰竭中的具体作用。(2)CCR5和其相应的趋化因子配体(CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β和CCL5/RANTES)在MHV-3诱导的暴发型肝衰竭中对NK细胞迁移募集的具体机制。[研究方法]1.采用MHV-3腹腔途径感染Balb/cJ小鼠建立暴发型肝衰竭模型。2.流式细胞术用于检测MHV-3感染0,24,48和72h后Balb/cJ小鼠肝脏、脾脏、外周血和骨髓中NK细胞CD69表达的百分率。肝脏CD69+NK细胞与肝损伤水平的相关性进行分析。3.流式细胞术用于检测MHV-3感染0,24,48和72h后CD69+NK细胞及CD69-NK细胞功能性标记(CD107a),活化性和抑制性受体(NKG2D和NKG2A)的表达量。胞内因子染色法检测其促炎细胞因子(IFN-γ、TNF-α及IL-9)的表达水平。4.流式细胞术检测MHV-3感染0,12,24,48和72h后Balb/cJ (?)、鼠肝脏、脾脏、外周血和骨髓中NK细胞CCR5表达的百分率。肝脏免疫荧光双染法检测CCR5+NK细胞在MHV-3感染后在肝脏的迁移募集情况。5. ELISA和免疫组化法用于检测MHV-3感染0,12,24,48和72小时后CCR5配体(MIP-1α、和RANTES)在肝脏的表达水平。实时定量PCR用于检测在MHV-3感染0,24,48和72小时后肝细胞MIP-1α、MIP-1β和RANTES的mRNA表达水平。6. Transwell细胞迁移实验是用来证实MHV-3感染的肝细胞对脾脏NK细胞的趋化作用,以及CCR5和其相应的趋化因子(MIP-1α, MIP-1β和RANTES)在脾脏NK细胞迁移至肝脏中的作用。7.转移过继实验用于评估将脾脏CCR5+NK细胞或CCR5-NK细胞通过尾静脉注射至MHV-3感染NK细胞耗竭的Balb/cJ小鼠后,小鼠的生存时间的改变。转移过继实验24小时后,HE染色用于观察小鼠肝脏活组织病理改变；测定血清ALT和AST水平用于评估肝损伤水平；流式细胞术检测NK细胞在肝脏的绝对计数。[实验结果]1.肝脏NK细胞CD69的表达在感染后48小时(61.37±4.18%对0.92±0.12%,P<0.0001)显著增加,在感染后72小时达到最高(86.52±±2.97%对0.92±0.12%,P<0.0001)。与此相似的是,脾脏和骨髓中NK细胞CD69的表达在感染后48小时也显著增加(26.63±3.40%对1.37±0.42%,P=0.0193,脾脏；16.97±3.67%对0.80±0.12%,P=0.0454,骨髓),均在感染后72小时达到最高(66.13±6.49%对1.37±0.42%,P=0.0111,脾脏；29.13±±4.09%对0.80±0.12%,P=0.0191,骨髓)。此外,外周血中NK细胞CD69的表达与肝脏趋势一致,在感染72小时达到最高(6.40±0.44%对1.16±0.09%,P=0.0077),但在感染48小时增加无统计学差异。2.血清ALT水平在感染后48小时显著增加,并于感染后72小时达到最高(11880.0±1174.0IU/ml对23.0±1.53IU/ml, P<0.0001), AST于感染后72小时达到最高(23907±1199.0IU/ml对78.33±8.25IU/ml, P<0.0001)。感染后ALT及AST水平与肝脏NK细胞CD69的表达呈高度正相关(相关性分别为r=0.989和r=0.971),且均具有明显统计学差异(P<0.001)。3. CD69+NK细胞上CD107a表达量在MHV-3感染48小时增加(4.67±0.38%,P<0.001),72小时达到最高(12.8±0.8%,P<0.001)。NKG2D在感染48小时增加(2.48±0.67%,P<0.001),2小时达到最高(4.18±0.57%,P<0.001; NKG2A在感染后24小时CD69-NK细胞上增加(0.85±0.21%,P<0.001),而后下降。IFN-γ的表达水平在感染48小时增高(3.2±0.73%,P<0.001),在72小时达到最高(3.45±0.93%,P<0.001)；而TNF-α和IL-9水平在MHV-3感染48小时达到最高(10.83±0.70%和4.1±1.23%分别代表TNF-α和IL-9,P<0.001)。4. MHV-3感染后,CCR5+NK细胞在肝脏中的百分率显著增加,与正常对照组相比,在感染后24小时达到高峰(41%,P=0.0013)。与此相反,CCR5+NK细胞的脾脏和骨髓的百分率分别为40%和36%,均在感染后12小时达到峰值,随后下降。在外周血中CCR5+NK细胞与肝脏趋势相同,在24小时达到峰值(31%)而后下降。将FITC-标记的抗小鼠CD3或CD49b和PE标记的抗小鼠CD195(CCR5)用于肝脏连续切片的免疫荧光染色。CD3-CD49b+CCR5+细胞代表CCR5+NK细胞。在感染早期(24小时),CCR5+NK细胞为肝脏主要浸润的炎性细胞,而后其他炎性细胞(如T细胞)迁移至肝脏。这些结果表明,在MHV-3感染后早期CCR5+NK细胞从脾、骨髓和血液迁移募集至肝脏。5. ELISA法用于检测MIP-1α, MIP-1β和RANTES在肝脏中的表达,在感染后均逐渐上升,并于感染后72小时达到峰值,分别为94ng/ml (MIP-1α),0.8ng/ml (MIP-1β),和160ng/ml (RANTES)。免疫组化染色亦证明感染后72小时MIP-1α, MIP-1β和RANTES在肝脏中的表达量最高。感染后的肝细胞MIP-1α, MIP-1β, RANTES mRNA的表达呈上升趋势,至72小时分别上升269倍,2015倍和189倍。这些结果表明MHV-3感染后,CCR5配体趋化因子的表达在肝脏显著增加,于此同时,CCR5+NK细胞由外周器官趋化募集至肝脏。6.MHV-3感染的肝细胞能趋化脾脏NK细胞,不仅这种趋化效应能被抗CCR5的单克隆抗体阻断,而且可以被抗MIP-1α,抗MIP-1β,和抗-RANTES单克隆抗体分别阻断,但只有后两者具有统计学差异。Transwell细胞趋化实验证明,MHV-3感染的肝细胞能趋化脾脏NK细胞,同时CCR5和其相应的趋化因子(MIP-1β, RANTES)在此趋化过程中发挥了重要作用。7.过继转移实验证实将脾脏CCR5阻断的NK细胞经尾静脉回输至MHV-3感染已将NK细胞耗竭的Balb/cJ小鼠后,可将生存时间延长至84-90h。HE染色证实过继实验24小时后,CCR5+NK过继组大量炎性细胞浸润和肝细胞死亡,血清ALT/AST水平均高于CCR5-NK过继组,肝脏NK细胞绝对计数亦显著增高。这些结果提示阻断NK细胞上CCR5的表达可降低MHV-3感染后肝脏NK细胞趋化募集,从而减轻肝损伤,表明在FHF中CCR5在NK细胞的趋化募集方面起了重要的作用。[结论]1.在病毒诱导的肝衰竭模型中,Balb/cJ小鼠肝脏中CD69+NK细胞比例显著增加,于感染后72小时达到最高,在脾脏,骨髓及外周血中也有相同的趋势。CD69在肝脏NK细胞中的表达水平与肝损伤的严重程度(血清ALT及AST水平)呈正相关。肝脏CD69+NK细胞表达功能性标志(CD107a),活化性受体(NKG2D),以及胞内因子(IFN-γ、TNF-α和IL-9)的水平在感染后48-72小时显著上调,而抑制性受体(NKG2A)的表达量则在感染早期CD69-NK细胞中相对增加。由此我们推测,肝脏CD69+NK细胞通过提高脱颗粒及细胞毒性作用,增加炎性细胞因子的产生参与肝细胞损伤,从而在暴发型肝衰竭的发病机制中起了重要的作用。2.在病毒诱导的肝衰竭模型中,趋化因子MIP-1α, MIP-1β, RANTES在肝脏感染过程中持续增加,CCR5+NK细胞从脾脏、骨髓和血液趋化募集至肝脏,并在感染后24小时达到高峰。Transwell细胞趋化实验表明感染的肝细胞能趋化脾脏NK细胞,并且这种效应能被抗CCR5的单克隆抗体阻断；中和MIP-1β和RANTES,亦可降低对脾脏NK细胞的趋化效应。将脾脏CCR5-NK细胞经尾静脉回输至MHV-3感染已将NK细胞耗竭的Balb/cJ小鼠后,可将生存时间延长至84-90h。这些结果表明,CCR5及其配体MIP-1β和RANTES在MHV-3诱导的肝损伤中对NK细胞向肝脏的趋化募集发挥了重要的作用。