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第一部分短发夹状RNA对人肝癌细胞株COX-2的抑制作用目的构建针对人COX-2基因的短发夹状RNA真核表达载体质粒,观察shRNA对人肝癌细胞COX-2表达的影响,为探讨RNA干扰作用及机制提供实验基础。方法设计合成针对COX-2的两条shRNA模板序列,将其插入含有U6启动子的pGenesil-1载体中,得到shRNA真核表达载体质粒WBH1和WBH2,并设阴性对照质粒HK。阳离子脂质体介导下转染人肝癌细胞株HepG2和BEL7402,荧光显微镜下观察转染率。应用RT-PCR法和Western blot法分别检测两株细胞转染后24h、48h、72h和96h的COX-2表达变化。结果经酶切分析和测序证实COX-2shRNA真核表达载体已成功构建。质粒在HepG2细胞和BEL7402细胞中的转染率分别为60%,54%。质粒WBH1导入细胞24h、48h、72h和96h后,RT-PCR法检测COX-2mRNA表达抑制率,上述4个时间点HepG2细胞分别为18.5%,88.6%、52.8%和42.4%(P<0.01),BEL7402细胞分别为9%,45.1%、70.1%和56.3%(P<0.01)。Western blot法检测蛋白抑制率,HepG2细胞分别为10.2%、80.5%、45.3%和39.0%(P<0.01)。BEL7402细胞分别为8.3%、40.2%、66.4%和35.6%(P<0.01)。HepG2细胞和BEL 7402细胞分别以48h和72h抑制效果最强。质粒WBH2对COX-2的表达无影响(P>0.05)。结论针对人COX-2的shRNA真核表达载体能明显抑制不同肝癌细胞株的COX-2表达,其抑制效果与靶点的选择有关。第二部分COX-2短发夹状RNA对人肝癌细胞株HepG2黏附侵袭力的影响目的研究针对人COX-2的shRNA真核表达载体对肝癌细胞株HepG2黏附力和侵袭力的影响。方法以质粒WBH1和阴性对照质粒HK体外转染48h后的HepG2细胞为检测细胞,未转染细胞作为空白对照。MTT法观察HepG2细胞与细胞外基质Matrigel黏附性的变化。Transwell小室实验以穿过人工基底膜的细胞数量评估HepG2细胞体外侵袭力的变化。结果转染WBH1质粒的HepG2细胞与Matrigel的黏附率为(6.0±0.4)%,与空白对照组[(11.4±0.2)%]相比明显下降(P<0.01),抑制率为47.4%。转染WBH1质粒的细胞穿膜数为(8.25±1.50),与空白对照组(22.75±1.70)相比有显著差异(P<0.01),抑制率为63.7%。转染阴性对照质粒HK的细胞黏附率和穿膜细胞数均无明显变化(P>0.05)。结论针对COX-2的shRNA真核表达载体能有效抑制HepG2细胞的体外黏附和侵袭力,为肝癌的治疗提供了新的途径。