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秋水仙又称秋番红花或藏红花,百合科(liliaceae)多年生草本植物,原产于欧洲和地中海沿岸。秋水仙的药用部位多为球茎,秋水仙碱是其主要药效成分。秋水仙碱临床常用来治疗痛风、肿瘤、肝炎等疾病,但它具有一定的毒副作用,如能引起恶心、肠麻痹、胃出血等,过量会损伤脏器,甚至引起动物死亡。而目前关于秋水仙药材中秋水仙碱是否为主要的毒性成分及其肝毒性机理依然知之甚少。因此,本文首先应用HPLC确定秋水仙总碱和秋水仙粗提物中秋水仙碱的含量,以此为依据确定了具有相同含量秋水仙碱的秋水仙样品体外肝毒性研究浓度,其次,采用不同来源的细胞系(人正常肝细胞系L-02,人肝肿瘤细胞系HepG2和大鼠肝正常细胞系BRL 3A),通过观察秋水仙样品对不同细胞形态变化的影响及应用MTT法检测细胞存活率和LDH释放量研究秋水仙样品对不同来源肝细胞的细胞毒性,并比较不同的秋水仙样品对不同细胞系之间的细胞毒性是否具有差异。最后,以更接近人源的人肝正常细胞系L-02为研究对象,比较不同秋水仙样品间对L-02细胞系的毒性,探讨秋水仙中的主要毒性物质成分是否是秋水仙碱。同时,应用ELISA法体外检测临床上常用的肝功能指标AST和ALT的活性,以此反映秋水仙样品对肝细胞功能的影响,并通过PI単染检测细胞周期、Hoechst/PI双染及Annexin V/PI双染观察并定量分析细胞凋亡情况、流式细胞术检测细胞线粒体膜电位变化情况、检测Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的活性及Western Blotting检测促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达情况探讨秋水仙诱导肝细胞毒性的主要毒性机制。结果表明,秋水仙样品均能对不同的细胞系产生细胞毒性,并对不同的细胞系间的作用相当。通过比较秋水仙样品间对L-02细胞毒性发现,各秋水仙样品的作用相当,说明秋水仙碱可能是秋水仙中的主要毒性成分。对肝细胞功能研究发现,秋水仙样品均能增加AST和ALT活性,但是与对照组相比无显著差异,这可能说明,AST和ALT不是体外研究肝毒性的敏感指标。最后对秋水仙引起细胞毒性的主要毒性机制研究结果发现,秋水仙样品均能将L-02细胞周期阻滞在G2/M期,并能诱导细胞的早期凋亡,但是不同浓度的样品间无差异。同时,秋水仙碱能激活Caspase 3和Caspase 9的活性,而对Caspase 8的活性无影响,并且能上调促凋亡蛋白Bax和下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低线粒体膜电位,说明,秋水仙诱导细胞凋亡主要是通过线粒体介导的内源性凋亡途径进行的。