研究背景和目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis, As)是心血管疾病的早期病理过程,从As产生到出现临床症状要经过数十年的发展,在此漫长的过程中,人们往往忽略危险的存在,又因传统的防治措施作用有限,使As的发展难以遏制。减缓乃至逆转As的发生发展是防治心血管疾病,提高人们生活质量的客观要求,因此,明确As发生发展机制,寻找早期有效的防治As的靶点十分必要。通过从基因水平、细胞水平和整体水平对As广泛而深入的研究发现,内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞(Smooth musle cells, SMCs)是构成粥样斑块的主要细胞成分,血管内皮功能失调、SMCs增殖和脂质沉积是粥样斑块形成的三个重要环节,巨噬细胞转化为泡沫细胞是其中的关键步骤。但是,这一系列过程的详细机制仍不十分清楚。目前有关As的研究较多集中在血管内皮细胞损伤和SMCs增殖,对巨噬细胞转化为泡沫细胞的机制及其调控研究较少,国内少见报道。近年研究发现,非对称性二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine, ADMA)血浆水平在冠心病、高血压、高血脂、糖尿病、高同型半胱氨酸血症、胰岛素抵抗、心力衰竭、肾功能衰竭时明显升高,其作用及机制成为人们关注的焦点。ADMA是内源性一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)的竞争性抑制剂,可致内皮功能受损、SMCs增生,在巨噬细胞泡沫化中的作用尚不清楚。NOS分为神经型(Neural nitric oxide synthase, nNOS)、内皮型(Endothelial oxide synthase, eNOS)和诱导型(Inducible oxidesynthase, iNOS)三种。nNOS和eNOS是机体正常存在的,大多数学者认为iNOS在正常情况下几乎不表达,当细胞受到炎症因子、免疫因子等刺激时表达增加。氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein, oxLDL)对粥样硬化形成过程中泡沫细胞聚集有重要作用,细胞摄取oxLDL由数种清道夫受体介导,血凝素样低密度脂蛋白受体-1 (Lectin-like low density lipoprotein recepter-1, LOX-1)是其中最特异的oxLDL受体。LOX-1主要在人冠状动脉内皮细胞、牛主动脉内皮细胞、兔和大鼠主动脉表达,在巨噬细胞、血小板和SMCs也有少量表达。研究表明,ADMA可上调血管内皮细胞、SMCs和巨噬细胞株NR8383 LOX-1表达,提示ADMA与As可能密切相关。本研究拟采用分子生物学实验方法,用ADMA干预oxLDL预处理的原代培养大鼠腹腔巨噬细胞,观察巨噬细胞iNOS和LOX-1表达,以探讨ADMA对巨噬细胞泡沫化的影响及机制;给高脂饲养的大鼠ADMA后,检测大鼠主动脉脂质沉积及iNOS和LOX-1表达,以期对ADMA在大鼠粥样硬化中的作用及机制进行初步探讨,为ADMA成为心血管疾病防治靶点提供可能的理论依据。方法1.体外细胞学实验:Wistar大鼠42只。分离培养大鼠腹腔巨噬细胞。实验分组及处理:①对照组:巨噬细胞与PBS (PH6.8)孵育48h。②oxLDL组:巨噬细胞与oxLDL(终浓度50μg/mL)共育48h。③0+A组:先以oxLDL(终浓度50μg/mL)与巨噬细胞共育24h,再加入ADMA(终浓度15μmol/L)继续孵育24h。④0+A+L组:先以oxLDL(终浓度50μg/mL)与巨噬细胞共育24h,再加入ADMA(终浓度15μmol/L)和L-Arg(终浓度1.2mmol/L)继续孵育24h。收集细胞和培养液,测定细胞内胆固醇含量及培养液NO水平和iNOS活性,提取细胞总RNA和总蛋白,分别通过半定量RT-PCR和Western-blot检测巨噬细胞iNOS,LOX-1 mRNA和蛋白表达,以β-actin为内参照进行标化。每组重复3次。2.动物体内实验:Wistar大鼠48只,随机分为四组:①正常对照组(n=8):标准大鼠饲料,正常饮水。②高脂组(n=12):高脂饲料,正常饮水。③ADMA组(n=14):高脂饲料,正常饮水,ADMA (0.2mg/Kg/d)灌胃,每日一次。④ADMA+L-Arg组(n=14):高脂饲料,饮水中含3% L-Arg,ADMA(0.2mg/Kg/d)灌胃,每日一次。饲养满18周后取血,测定大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、NO及iNOS水平,取胸主动脉做病理切片,观察其病理变化。以半定量RT-PCR和Western-blot分别检测主动脉iNOS和LOX-1 mRNA及蛋白表达,以β-actin为内参照进行标化。结果1.体外细胞学实验:①oxLDL组和O+A组巨噬细胞内胆固醇含量较正常对照组明显增加(均p<0.01),且O+A组较oxLDL组升高更明显(p<0.05),而O+A+L组胆固醇含量较O+A组降低(p<0.05)。②与正常对照组和oxLDL组相比,0+A组NO含量降低(p<0.01或p<0.05);0+A+L组NO含量较0+A组显著升高(p<0.05)。③与正常对照组和oxLDL组相比,0+A组iNOS活力明显升高(均p<0.05),0+A+L组iNOS活力较0+A组降低(p<0.05)。双变量相关性分析显示,NO含量与iNOS活力呈负相关(r=-0.697, p=0.012)。④与正常对照组和oxLDL组相比, O+A组iNOS mRNA和蛋白表达量显著增加,其差异均有显著性(均p<0.01);O+A+L组iNOS mRNA和蛋白表达较O+A组降低(均P<0.01)。⑤O+A组LOX-1 mRNA和蛋白表达较正常对照组和oxLDL组增强,其差异均有显著性(均p<0.05);与O+A组相比,O+A+L组LOX-1 mRNA和蛋白表达降低,两组差异有显著性(p<0.001或p<0.05)。2.动物体内实验:①主动脉病理切片显示正常对照组血管内膜光滑、完整,无脂质沉积;高脂组血管内膜光滑、完整,有少量脂质沉积;ADMA组血管内膜断裂,内膜下有明显脂质沉积,血管中层SMCs增生明显,且排列紊乱;ADMA+L-Arg组血管内膜完整,脂质沉积和SMCs增生较ADMA组减弱。②ADMA组大鼠血清NO水平和iNOS活性明显升高,与正常对照组和高脂组比较有统计学差异(p<0.01或p<0.05),ADMA+L-Arg组NO水平和iNOS活性较ADMA组明显下降(均p<0.05)。双变量相关性分析显示,NO与iNOS间呈正相关(r=0.512, p=0.003)。③高脂组、ADMA组和ADMA+L-Arg组血清TG和TC水平均升高,与正常对照组相比有显著性差异(均p<0.01)。④ADMA组大鼠主动脉iNOS mRNA和蛋白表达量与正常对照组和高脂组相比显著上调(p<0.001或p<0.05);ADMA+L-Arg组iNOS mRNA和蛋白表达量较ADMA组明显降低(均p<0.01)。⑤ADMA组大鼠主动脉LOX-1 mRNA和蛋白表达量较正常对照组和高脂组显著上调(p<0.01或p<0.001);与ADMA组相比,ADMA+L-Arg组LOX-1 mRNA和蛋白表达量明显降低,其差异有显著性(p<0.01或p<0.05)。结论①ADMA可促进培养的大鼠腹腔巨噬细胞摄取oxLDL,促进巨噬细胞泡沫化。②ADMA可促进高脂饲养大鼠主动脉脂质沉积。③上调iNOS和LOX-1表达可能是ADMA促进泡沫细胞形成和脂质沉积的内在机制之一,有效抑制ADMA的作用可能是早期防治As的靶点。