论文部分内容阅读
我国目前铅污染程度非常严峻,铅是一种重金属元素,是目前最常见的工业及环境毒物,可在环境中长期蓄积,对环境甚至食品造成污染,构成对人类长期的危害。铅对人体却没有任何生理功能,铅会通过血脑屏障(blood-brain barrierBBB)进入脑神经组织,导致营养物质和氧气供应不足发挥神经毒性作用。另外,儿童作为特殊群体,相比成人对铅的神经毒性更为敏感,已经证实铅具有很强的神经发育毒性,铅暴露的年龄越小,对铅神经毒性的易感性越高。铅易透过胎盘屏障及通过乳汁分泌,胎儿及婴幼儿对铅的神经毒性更易敏感。铅无安全临界水平,铅对神经系统损害可发生在现有临床血铅浓度检测标准以下,并且儿童发育早期铅暴露所产生的智力损害可持续到成年阶段。目前,针对铅暴露现临床主要以预防为主,治疗为辅,尚缺乏有效药物能够解决铅神经毒性的影响。为治疗铅引起的神经毒性损伤,深入研究铅神经毒性分子机制是非常必要的。目前铅神经毒性分子机制研究中一个重要的内容就是探讨铅对中枢神经系统(central nervous system, CNS)信号途径传导过程中钙离子(calcium,Ca2+)和蛋白激酶功能的影响。铅通过影响细胞内Ca2+正常流动,干扰神经细胞膜对Ca2+的摄取和释放,扰乱细胞内Ca2+稳态而发挥毒性作用。铅也可取代Ca2+与钙调素(calmodulin, CaM)结合或直接与CaM结合,使之改变构型,并可结合及激活其依赖性酶与载体在内的调节蛋白,干扰神经细胞的功能。但是Ca2+/CaM依存的信号途径介导铅神经毒性的复杂分子机制尚不完全清楚,因此进一步深入研究铅对神经系统Ca2+/CaM依赖性信号分子表达的影响对了解铅介导神经毒性分子机制具有重要意义。大量研究表明,铅可诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生,使细胞的氧化还原状态发生改变,促使细胞和组织产生自由基,引起自由基生成增多,氧化损伤在铅毒性机制中发挥着重要作用。另外已经了解到,当组织细胞受到损伤或Ca2+稳态失衡时,细胞内自噬溶酶体(autolysosome)会激活,从而可以保护细胞免受细胞内毒物的损伤,但是过多的细胞自噬(autophagy)也会引起细胞过量损伤而发生程序性死亡。有报道铅暴露会导致附睾上皮细胞自噬增加,但铅暴露时是否会对神经细胞自噬水平产生影响未见有研究报道,自噬溶酶体信号转导途径是否参与铅神经毒性过程尚不清楚。本研究通过建立大鼠急性铅暴露模型,测定大鼠血铅浓度和脑组织铅含量,检测脑海马腹-背轴Ca2+/CaM依赖性信号分子的表达；建立大鼠慢性铅暴露模型及进行药物处理,检测断乳期仔鼠及药物处理后子代大鼠的血铅浓度和脑组织铅含量,并检测子代大鼠学习记忆能力,然后检测脑区Ca2+/CaM依赖性信号分子与自噬相关蛋白的表达,通过探讨以期发现其中的内在联系,为铅暴露神经毒性分子机制研究及创新药物治疗靶点提供重要线索。对于慢性铅暴露模型,我们使用具有清除自由基抗氧化作用的钙调素抑制剂美拉托宁(melatonin)对子代大鼠进行维期60天的调控干预,以期为临床治疗铅神经毒性提供相关研究依据。第一章急性铅暴露大鼠海马腹-背轴钙离子／钙调素依赖性信号分子表达研究目的：研究铅暴露下腹侧海马与背侧海马是否存在不同的神经生物化学改变。方法：建立大鼠急性铅暴露模型,Sprague Dawley (SD)大鼠随机分成3组,2个铅处理组(Low lead-exposed group、High lead-exposed group)每天分别腹腔注射25mg/kg和50mg/kg的醋酸铅,对照组(Control group)采用蒸馏水,持续5天。然后收集血样与脑组织样本,用石墨炉原子吸收分光光度法测定血铅浓度与脑组织铅含量,通过western blot(?)去检测背侧海马(doral hippocampus)和腹侧海马(ventral hippocampus) Ca2+/CaM依赖性蛋白的表达,包括钙蛋白酶(calpain)的特殊底物血影蛋白(spectrin),钙调磷酸酶(calcineurin),磷酸化钙离子／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(phosphorylation of calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, p-CaMKⅡ)和神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS).另外,通过免疫组织化学法检测了腹侧海马calcineurin的表达。结果：经过5天的急性铅暴露,血铅浓度与脑组织铅含量均显著性升高(P<0.01),其中海马铅含量高于其它脑区铅含量。我们在腹侧海马观察到了calcineurin的结构活性形式(45kDa和48kDa),同时也观察到了calpain激活引起spectrin降解的作用。我们的研究数据显示,在急性铅暴露后,nNOS在腹侧海马的表达显著地高于背侧海马(p<0.05),同时,相对于背侧海马而言,p-CaMKⅡ (Thr286)水平在腹侧海马表达显著降低(P<0.05)。结论：现有数据表明急性铅暴露会导致海马腹-背轴Ca2+/CaM依赖性信号分子呈现不同的表达模式。本章研究结果提示,相比背侧海马来说,腹侧海马可能更易受到铅神经毒性的影响。第二章慢性铅暴露大鼠脑区钙离子／钙调素依赖性信号分子表达及药物调控研究目的：深入探索慢性铅暴露对大鼠脑区Ca2+/CaM依赖性信号分子表达及药物调控研究。方法：首先建立仔鼠慢性铅暴露模型,SD大鼠受孕后随机分成4组,对照组(Control)给予蒸馏水,3个处理组(L-lead. M-lead和H-lead)分别给予0.5g/L、1.0g/L和2.0g/L的醋酸铅饮用水。孕鼠自孕16天起自由饮用直至新生仔鼠21天断乳为止,仔鼠由母鼠喂养至断乳后与母鼠分笼饲养,并收集仔鼠血样与脑组织样以石墨炉原子吸收分光光度法进行测定,剩余仔鼠开始饮用与其母鼠相同含量的醋酸铅饮用水直至60天成熟期。然后基于仔鼠慢性铅暴露模型,构建5组慢性铅暴露模型与药物处理组,4个处理组(L-lead或L. L-lead+Melatonin或L+M、H-lead或H. H-lead+Melatonin或H+M)继续饮用原相同含量的醋酸铅饮用水,L+M组和H+M组每天灌胃美拉托宁溶液,剂量为5mg/kg,对照组(Control或C)继续给予蒸馏水,持续60天。以Morris水迷宫观测子代大鼠学习记忆能力的变化,并收集血样与脑组织样以石墨炉原子吸收分光光度法进行测定。用、western blot(?)去检测脑区Ca2+/CaM依赖性蛋白的表达,包括CaMKⅡ途径和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)途径关联蛋白表达。结果：仔鼠慢性铅暴露模型中,21天铅暴露仔鼠血铅浓度与脑组织铅含量显著高于对照组(P<0.05)。慢性铅暴露模型与药物处理后,Morris水迷宫测定结果显示铅暴露组逃避潜伏期(escape latency)、目标象限停留时间(time in correct quadrant)及过台次数与对照组相比无显著性差异,药物处理组与铅暴露组相比亦无显著性差异；与同一天的对照组相比,第1天低剂量铅暴露组与对应的美拉托宁处理组、第2天低剂量铅暴露美拉托宁处理组短期记忆时间(short-term memory)显著增多(P<0.01),各天美拉托宁处理组与对应的铅暴露组相比无显著性差异。铅暴露组血铅、海马铅、皮层铅与纹状体铅含量均显著高于对照组(P<0.05),美拉托宁处理组血铅浓度、脑组织铅含量与对应的铅暴露组相比无显著性差异。随着铅暴露剂量的升高,我们观察到海马CaMKⅡ (Thr286位点)磷酸化活性减弱而p-Synapsin I (Ser603)和p-GluR1(Ser831)水平表达代偿性升高,此外,慢性铅暴露后海马p-ERK (Thr202/Tyr204)表达上调,海马PKC途径中NMDAR1表达增加,p-MARCKS (Ser152/156)表达减少,高剂量慢性铅暴露组海马p-NR1(Ser896)与MARCKS表达增加。美拉托宁处理后对高剂量慢性铅暴露海马p-GluRl (Ser831)、p-ERK (Thr202/Tyr204)、NMDAR1、p-MARCKS (Ser152/156)与MARCKS有一定的逆转调控作用。此外,慢性铅暴露组纹状体CaMKⅡ途径和PKC途径关联蛋白表达相对于对照组无显著的变化。结论：本章研究结果表明慢性铅暴露对大鼠短期学习记忆产生了影响,海马Ca2+/CaM依赖性信号分子系统的稳态失衡参与了铅神经毒性分子机制过程,本研究的实验周期及治疗疗程条件下,美拉托宁对高剂量慢性铅暴露大鼠海马p-GluR1(Ser831)、p-ERK (Thr202/Tyr204)、NMDAR1、p-MARCKS (Serl52/156)与MARCKS有一定的逆转调控作用。第三章慢性铅暴露大鼠脑区自噬相关蛋白表达及药物调控研究目的：探索自噬溶酶体信号转导途径是否参与介导铅神经毒性分子机制过程及药物调控研究。方法：以第二章慢性铅暴露模型与药物处理所收集脑组织为研究对象,用western blot(?)去检测海马与皮层自噬相关蛋白的表达,具体包括Beclin1.微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1light chain3, LC3)、核孔蛋白(nucleoporin, p62).溶酶体相关膜蛋白2(lysosomal-associated membrane protein2, LAMP2)、组织蛋白酶B(cathepsin B)。结果：经过检测发现,相对于各自的对照组来说,在脑海马神经细胞低剂量铅暴露组Beclin1表达明显下调(P<0.05)；高剂量铅暴露组Beclin1表达明显上调(P<0.05),LC3有极显著上调(p<0.001),cathepsin B在38kDa处有明显下调(P<0.001),30kDa与25kDa处片段有下调趋势,但无显著性的差异。在脑皮层神经细胞,发现低剂量铅暴露组p62表达显著上调(p<0.05)；高剂量铅暴露组LC3、p62与LAMP2表达均有显著增加(P<0.05)。美拉托宁处理组与对应的铅暴露相比,各个自噬相关蛋白表达均无显著性差异。结论：本章研究结果表明慢性铅暴露可能会对神经细胞自噬水平产生影响,并且不同海马与皮层出现不同的自噬现象,不同剂量铅暴露出现不同的自噬现象,这些不同的自噬现象反映了脑区对铅神经毒性代偿与失代偿的不同反应,我们推测自噬溶酶体信号转导途径可能参与介导了铅神经毒性分子机制过程。本研究的实验周期及治疗疗程条件下,美拉托宁未对慢性铅暴露海马与皮层脑区自噬水平起到调控作用。