天然免疫是机体在进化中形成的古老免疫系统，构成机体抵御病原生物入侵的第一道防线。病原入侵后，天然免疫系统识别病原，产生细胞因子，同时激活炎症反应。适当的炎症反应反有利于杀死、清除病原体，促使组织损伤愈合，但过度的炎症反应则导致疾病的发生，甚至死亡。miRNA通过靶向编码基因mRNA3UTR，在转录后水平上对基因表达进行调控。目前的研究证明，miRNA参与天然免疫系统的多个环节，包括免疫细胞分化、发育，TLR受体基因表达，胞内TLRs信号转导，细胞因子生成、分泌，病毒感染、复制等。在病原感染时，miRNA不仅是重要的天然免疫活化后的信号调节分子，而且能够直接参与机体清除病原的过程。深入理解miRNA对天然免疫的调控作用有助于调节机体免疫应答和维护免疫平衡，控制过度的免疫反应，引导炎症反应向着有利于动物健康方向发展。本研究以小鼠为动物模型，首先腹腔注射LPS构建全身系统性炎症综合症(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)小鼠，从基因学水平比较SIRS小鼠与对照小鼠脾脏微小RNA(miRNA)表达谱，获得LPS效应miRNA基因；其次，结合miRNA靶基因预测和表达谱分析确定对LPS所引起的炎症反应有调节作用的基因microRNA-1224(miR-1224)。然后检测了miR-1224对炎性基因TNFα、IL1β生成，以及对NF-κB转录活性的作用，以验证miR-1224是否参与了LPS/TLR4信号通路和对炎性基因生成的影响。最后，检测了miR-1224对靶基因偶联荧光素酶活性、靶基因表达的干扰作用，探讨miR-1224对LPS/TLR4信号通路调控作用的分子机制。　　 (1)成功构建内毒素所致小鼠SIRS模型。　　 采用腹腔注射LPS的方法，诱使小鼠出现SIRS/MODS症状。组织病理学检查结果显示，SIRS小鼠肝、脾、肺、肾均可见充血水肿、炎性细胞浸润、组织结构坏死。与对照相比，SIRS小鼠肝、脾、肺、肾中TLR4、IL-1β和TNFα基因表达量在注射后6h、12好、均发生明显改变。TLR4基因在脾、肺中表达量呈现震荡-升高的趋势，mRNA水平在6h下降后，12h后都显著升高(P＜0.05)，尤其在肺中，TLR4的表达量上升了64.5％。相对脾、肺，TLR4在肝中表达量不高，但当LPS刺激6h后，其mRNA水平上升45.9％。IL-1β在肝、脾、肺中表达量都急剧上升。在LPS刺激后6h和12h，IL-1β在肝中表达量分别上升5.68倍和13.1倍，而在脾上IL-1β水平呈现先高后低的事态：6h后生生3.69倍，12h后下降至65.8％。IL-1β在LPS刺激后的肺中表达则呈现先降低后升高的趋势：在6h后，IL-1β水平下降至检测极限，而12h后又较之对照上升4.39倍。在应答LPS刺激过程中，其在这四个组织中表达呈现不同趋势。LPS刺激后，TNFα在肝中表达持续下降，至12h时下降超过50％；在脾上，6h后达到高峰，12h下降低于对照水平；而在肺中，TNFα基因持续上升，12h上升7.9倍。　　 (2)获得19个LPS效应miRNA，画出miRNA-mRNA相互作用图，网络解析miRNA在应答LPS刺激过程作用及潜在的分子机制。　　 使用microRNA表达谱芯片比较LPS注射小鼠和对照小鼠的脾脏的miRNA表达变化，结果发现在LPS注射小鼠脾脏中有19个miRNA表达量上调。其中miR-146b、miR-155、miR-494和miR-1224最大变化倍数分别为1.61、2.75、4.17和5.75倍。用Stem-loop real-time PCR检测试验样品中这四个miRNA水平，发现其变化趋势跟芯片结果一致。用生物信息学分析差异表达miRNA，预测到1781个靶基因。对这些靶基因进行功能聚类分析(GO分析)，结果显示与LPS信号转导和应答过程直接相关基因有169个，包括MAPK信号转导通路基因57个，Jak-STAT信号转导通路基因26个，细胞因子-受体相互作用通路基因34个，钙离子信号转导通路基因27个，趋化因子信号转导通路基因25个。根据靶基因预测与GO分析，获得miRNA-mRNA网络式的相互作用图，解析miRNA潜在的作用机制。根据这张图，我们推测miR-1224在应答LPS刺激中可能起负反馈调节作用。　　 (3)miR-1224负调控TNFα、IL-1β、IL-6表达，但不是通过调节NF-κB转录活性而实现的。　　 在小鼠类巨噬细胞RAW264.7细胞系中，过表达miR-1224导致TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA明显表达下降，而功能缺失miR-1224时TNFα、IL-1β、IL-6mRNA水平高于对照细胞。表明miR-1224负调控TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA。这验证了前面我们的推测。有趣的是，在RAW264.7细胞中过表达miR-1224，NF-κB转录活性高于对照，表明miR-1224正调节NF-κB转录因子的活性，同时也说明miR-1224对TNFα、IL-1β、IL-6基因表达的负调控作用不是通过调节NF-κB转录因子活性而实现的。　　 (4)miR-1224靶向调节Sp1蛋白。　　 HEK293细胞中共转染miR-1224 mimics和携带SP13UTR序列的融合质粒psicheck2-SP13UTR，荧光素酶活性比对照下降64％。RAW264.7细胞中转染miR-1224 mimics，检测SP1 mRNA水平和蛋白水平；Real-time PCR和westem blot结果表示miR-1224在转录后水平靶向调控SP1基因。　　 (5)成功构建、纯化腺病毒介导的miRNA前体表达载体。　　 在HEK293细胞中共转染pCD-pre-mir-1224融合质粒和腺病毒骨架治理，转染6天后出现CPE，12天后CPE增多，大部分细胞变圆脱落，反复冻融法收毒(P1代)。用P1代重组腺病毒复感染HEK293细胞，扩大培养，收毒后氯化铯梯度离心纯化腺病毒颗粒。用针对病毒基因组的PCR和针对感染病毒HEK293细胞总RNA的RT-PCR验证病毒正确性和活力。