牙周牙髓疾患、外伤以及先天、遗传性疾病常常导致牙齿缺失，严重影响咀嚼功能和颜面美容。义齿修复治疗是临床解决缺牙问题的常用方法，但义齿缺乏自然牙的感觉和形成能力，仅能有限地恢复咀嚼功能。如何利用人工方法设计和制造出具有生物学活性的牙齿，并用于修复缺牙，是国内外学者所追求的目标和着力研究的热点课题。但由于缺乏对牙齿组织结构和发育形成机制的透彻了解以及相关技术的支持，此领域的研究一直未能取得突破性进展。目前，国际上已有研究发现体外分离的人牙髓干细胞在裸鼠体内可形成牙本质牙髓复合体，但有关用体外培养的胚胎期人牙源性上皮和间充质细胞构建牙齿样结构的研究尚未见报道。 牙齿是一种多胚层起源的器官，是胚胎期的牙源性上皮和间充质在一系列信号分子组成的信号网络的严密调控下，发生复杂的交互式作用而形成的。其中，牙釉质是由牙胚发育早期的牙源性上皮细胞形成的，而牙本质牙髓复合体则是由其周围的牙源性间充质细胞所形成。牙源性上皮和间充质细胞属于胚胎期的细胞，具有较强的增殖活性和分化能力，二者之间的相互诱导作用对于牙齿发育意义重大。本研究将此理论与组织工程学思想相结合，模拟体内牙胚发育的生理机制，将体外培养的人牙源性上皮和间充质细胞作为种子细胞，接种于优选出的三维支架上，在免疫缺陷小鼠 第四军医大学博士学位论文体内建立牙源性上皮细胞复合间充质细胞的立体培养模型，以诱导形成含有釉质样组织和牙本质牙髓复合体的牙齿样结构，并对其进行鉴定分析。目的在于为牙周牙髓疾患的治疗和缺失牙的修复提供新思路，并为牙齿的再生和应用研究奠定良好的实验基础，也为其他多胚层组织和器官的重建开辟新途径。本课题主要进行了如下几方面的研究:1.人牙源性上皮细胞和间充质细胞的体外培养 利用显微分离和酶消化技术分离人发育早期牙胚的牙源性上皮和间充质组织，组织块法分别培养牙源性上皮细胞及间充质细胞，多次差别消化法和反复贴壁法进行纯化，倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况，免疫荧光染色鉴定细胞来源。结果显示，原代培养的人牙源性上皮细胞生长良好，但有少量间充质细胞混杂其中，经纯化后明显好转，上皮细胞呈片状生长，表达角蛋白及成釉蛋白。牙源性间充质细胞生长良好，状态稳定，表达波形丝蛋白。本实验成功建立了人牙源性上皮细胞和间充质细胞的体外培养体系，为牙齿组织工程研究提供了可靠的种子细胞来源。2.人牙源性间充质细胞向成牙本质细胞的诱导分化 应用bFGF+I GF一1或TGF一pl分别对培养早期的人牙源性间充质细胞进行平面定向诱导以及平面三维(以胶原凝胶为载体)联合诱导，观察诱导后细胞的形态学变化及其在胶原凝胶中的生长状况，采用免疫荧光染色和Rl飞PCR方法检测成牙本质细胞标志物—DSP蛋白和DSPP mRNA在诱导后细胞中的表达，并通过Von Kossa染色检测诱导后细胞的矿化能力。结果显示，诱导后部分细胞出现单侧较长的细胞突起，表达DSP蛋白和DsPP mRNA，体外连续培养可自发形成矿化结节，在平面和三维培养中均表现出较典型的成牙本质细胞的形态和功能特征，提示bFGF+I GF一1或TGF一pl可促进牙源性间充质细胞向成牙本质细胞分化，并可在三维培养体系中维持其分化表型不变。本实验为构建组织工程牙齿样结构提供了具有较强成牙能力的种子细胞。3.应用于构建组织工程牙齿样结构的支架材料的优选 将生长因子诱导后的人牙源性间充质细胞与胶原类材料、天然珊瑚、 4 第四军医大学博士学位论文陶瓷化骨以及collagraft复合材料相复合进行体外培养，采用扫描电镜和细胞计数法观察和比较细胞在各种三维支架中的生长、增殖情况。结果显示，细胞在胶原膜、陶瓷化骨和Collagraft复合材料表面伸展充分，生长良好，增殖活跃，细胞表面可见多数分泌颗粒，而天然珊瑚表面附着细胞很少，伸展不够充分，增殖也不明显。提示胶原膜、陶瓷化骨和Conagraft复合材料适宜牙源性间充质细胞的生长，但由于胶原膜无法为细胞生长提供矿物离子环境，而且坚韧性不高，因此本实验最终选择陶瓷化骨和Collagraft复合材料作为下一步构建组织工程牙齿样结构的支架材料。4.人牙源性间充质细胞体内立体培养模型的建立 将经生长因子诱导的人牙源性间充质细胞接种于复合同种生长因子或未复合生长因子的陶瓷化骨和collagraft复合材料上，将细胞/支架复合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，建立牙源性间充质细胞的体内立体培养模型，并设立相应的对照组。4周和10周后取材，对移植物进行组织学观察和免疫组化染色。结果显示，10周的实验组标本中，植入的细胞在未复合生长因子的支架上形成了不太典型的牙本质和牙髓样组织，而在复合生长因子的支架上形成了较典型的牙本质牙髓复合体样结构，新生的牙本质样组织和其内侧出现极化的细胞均表达人DSP。对照组及4周标本中未观察到此现象。提示用人牙源性间充质细胞在裸鼠体?