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目的:本研究旨在利用碱基猝灭探针技术,研发一种通过荧光波长和熔解温度闭管检测多重基因的高通量二维PCR(Two-dimensional PCR,2D PCR)技术。方法:给在同一荧光检测通道中检测的不同靶基因一条引物的5’端打上不同的、与碱基猝灭探针序列同源的标签序列,该标签可与探针序列完全相同,或在不同位置存在一个或多个碱基差异。PCR结束后行熔解曲线分析,让探针去识别PCR产物中的标签互补序列,在一个荧光通道中根据熔解温度(Melting temperature,Tm)值鉴别多个靶基因。用不同发射波长的荧光基团标记一组探针(每个荧光通道仅需一个探针),将多色荧光通道的检测波长作为纵坐标,Tm值作为横坐标,在荧光波长和温度这两个维度内建立二维PCR技术,实现单管反应批量检测靶基因的目的。本研究选定9种高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)和人血红蛋白等10种靶基因设计探针及对应的带标签的PCR引物建立二维PCR反应体系,用双色和三色荧光通道两种模式进行检测,通过敏感性试验、临床样本检测的一致性分析试验等对二维PCR进行性能评估。结果:本研究建立了可用于三色荧光通道的标签及探针序列库,成功应用二维PCR检测了所选的10种靶基因。双色荧光通道检测模式中,HPV 16型、HPV 18型、HPV 31型、人血红蛋白基因及HPV35型在FAM荧光通道中对应的熔解温度分别为41℃、48℃、52℃、60℃及 65℃;HPV45 型、HPV51 型、HPV52 型、HPV58 型及HPV68型在HEX通道中检测的熔解温度分别为48℃、54℃、60℃、63℃及71℃。在三色荧光通道检测模式中,仅人血红蛋白基因改为在Cy5检测通道中检测,熔解温度为72℃,其他不变。敏感性试验结果表明,2D PCR检测单基因的最低检出限为2×101拷贝/反应,双重感染模型中最低检出限为4×101拷贝/反应,在多重感染模型中二维PCR可成功检测出五种靶基因。一致性分析试验结果表明,二维PCR与其他两种方法比较的一致率分别为90.58%及92.14%,相应kappa值分别为0.8228及0.8403。结论:二维PCR技术具有在单管内同时检测多个靶基因的能力,特别适用于病原微生物的鉴定分型,也可用于多个单核苷酸多态性位点的分型检测和基因甲基化检测等领域。