目的:耐药细菌感染是临床抗感染治疗中极为棘手的问题,也是造成重症感染死亡的首要原因。其中被称为“超级细菌”的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在临床感染中的危害性日趋严重。患者一旦感染MRSA,治疗极为困难,常继发多重感染、脓毒性休克和多器官功能衰竭综合症,感染患者死亡率很高。目前临床上还没有特异性针对MRSA的有效抗菌药物,因此,如何有效控制细菌MRSA感染造成的危害已经成为各国政府高度关注的焦点,寻找和研制有效控制MRSA感染的新药物也成为当今世界各国科学家当务之急的研究目标。群体感应(Quorum sensing,QS)是广泛存在于细菌内的一种调控细菌群体行为的机制,参与细菌生物被膜形成、毒力因子释放、免疫逃逸、以及耐药性发生的重要调控系统。抑制细菌群体感应系统(Quorum sensing system,QSS)可以显著抑制细菌的致病性,但不影响细菌的生长,因而对细菌选择性生长压力小,具有不诱导细菌耐药的独特优点。因此,以QSS为靶标的新型抗菌药物研究,成为不易诱导耐药新型抗菌药物研究的新趋势和新热点,也是新型抗菌药物研究领域最有希望的突破口。附属基因调节子系统(accessory gene regulator,agr)是广泛存在于金黄色葡萄球菌的QSS,该系统激活后,启动其效应分子RNAⅢ的表达,进而调控其下游多种毒力因子的表达。抑制agr系统信号调控通路中的关键分子,可以抑制细菌多种毒力因子的表达,进而减轻细菌致病力。RNAⅢ抑制肽(RNAⅢ-inhibiting peptide,RIP)是一种作用于agr系统的抑制剂。业已证实,RIP能够有效抑制MRSA毒力因子释放,降低感染动物死亡率,减轻细菌生物膜的形成等,因此,RIP作为抗MRSA的有效抗菌药物备受关注。目前已知所有作用于QS的抑制剂在体外均无抑菌或杀菌作用,但在感染动物体内则表现出明显的抗菌作用。然而迄今为止,QS抑制剂体内抗菌的内在规律和机制几乎完全不清楚,这已成为制约新型抗菌药物RIP深入研究重要限速环节。本课题采用氨基酸替换、末端修饰、寡聚化等方法设计合成不同的RIP衍生物,体内外实验评价RIP衍生物抗菌活性,并探讨RIP衍生物体内抗菌作用的机理。方法:1.RIP衍生物的设计与合成以RIP-I的序列YKPITNF为模板,通过氨基酸替换,N-端乙酰化修饰,C-端酰胺化修饰,以及寡聚化修饰的方法,设计合成RIP-V、RIP-L、RIP1181、RIP1182、RIP1183五条RIP衍生物,采用RP-HPLC方法分析其纯度,采用ESI质谱仪或MALDI-TOF质谱仪鉴定合成多肽的分子量,确证合成衍生物多肽序列的正确性。2.RIP衍生物体内抗菌活性的筛选建立HA-MRSA感染小鼠脓毒症模型,分别检测RIP衍生物对感染小鼠生存率、脏器菌落计数、组织病理损伤等指标的影响,筛选出抗菌活性较优的RIP衍生物。3.RIP1183体外抗菌效果评价选择6株葡萄球菌(2株标准株和4株多药耐药菌株)体外培养,测定RIP衍生物RIP1183对6株葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC);细菌生长检测仪测定RIP1183对6株菌的生长抑制情况。4.建立不同感染模型评价RIP1183对小鼠治疗作用选择HA-MRSA(MRSA XJ75302)或CA-MRSA(LAC)菌株,分别腹腔注射、经鼻滴入和皮下接种MRSA方式感染小鼠,制备脓毒症、坏死性肺炎和皮肤感染模型,给小鼠腹腔注射不同剂量的RIP1183,观察RIP1183对小鼠生存时间和生存率的影响;通过小鼠脏器或组织中的细菌计数,观察RIP1183对体内细菌生长的影响;通过小鼠肺脏、肝脏或皮肤组织HE染色,观察RIP1183对组织损伤的保护作用。5.RIP1183体内抗菌作用机理探讨(1)按照环磷酰胺法缺失小鼠的中性粒细胞,并用LAC感染该小鼠建立脓毒症模型,腹腔注射RIP1183,观察中性粒细胞缺乏后对RIP1183抗菌作用的影响。(2)分离人外周血中性粒细胞与RIP1183共孵育,髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒测定中性粒细胞中的MPO,观察RIP1183对中性粒细胞内MPO活性的影响。(3)分离小鼠体内MRSA,采用实时定量PCR方法检测细菌RNAⅢ和毒力因子PVL、HLA、PSMα、PSMβ的表达,观察RIP1183对RNAⅢ和毒力因子表达的影响。(4)LAC细菌或细菌上清或HKSA(热杀死金黄色葡萄球菌),与人中性粒细胞共孵育,Western blot检测坏死性凋亡特征蛋白p MLKL的表达水平,观察LAC对中性粒细胞坏死性凋亡的影响。(5)PSMα和PSMβ缺陷菌上清与与人中性粒细胞共孵育,Western blot检测p MLKL的表达水平,观察PSMα和PSMβ对中性粒细胞坏死性凋亡的影响。(6)合成七种PSM多肽分子与人中性粒细胞共孵育,或提前加入MLKL抑制剂NSA,Western blot检测p MLKL的表达水平;透射电镜观察PSMα1对中性粒细胞形态的影响。(7)LAC及其PSMα缺陷菌建立坏死性肺炎模型,腹腔注射给予感染小鼠RIP1183或坏死性凋亡抑制剂Nec,免疫荧光法检测小鼠肺组织中的中性粒细胞坏死性凋亡、Western blot检测肺泡灌洗液中的中性粒细胞p MLKL的表达水平、流式细胞仪检测感染小鼠肺组织中的中性粒细胞死亡的比例。(8)LAC及其PSMα缺陷菌建立坏死性肺炎模型,腹腔注射给予感染小鼠RIP1183或坏死性凋亡抑制剂Nec,观察对小鼠生存率、肺损伤(HE染色)和肺组织中细菌数的变化。6.RIP1183安全性与药物代谢动力学评价(1)采用最大给药量法,大鼠或犬单次静脉注射RIP1183,观察其对大鼠或犬的一般体征、摄食、体重等指标的影响;(2)小鼠RIP1183静脉注射后,观察其对小鼠中枢神经系统的影响;比格犬RIP1183静脉注射后,观察其对比格犬心血管系统和呼吸系统的影响。(3)比格犬分别单次静脉注射2 mg/kg、4 mg/kg、8 mg/kg的RIP1183后,检测给药后不同时间点比格犬血浆中的药物浓度,计算该药物的药代动力学参数。结果:1.RIP衍生物的合成与鉴定采用固相合成的方法分别合成了RIP-I、RIP-V、RIP-L、RIP1181、RIP1182、RIP1183六条多肽,其中RIP-L和RIP-V,是RIP-I的4位氨基酸替换为亮氨酸或缬氨酸得到的,序列分别为YKPLTNF-CONH2和YKPVTNF-CONH2;RIP1183是将RIP-V乙酰化修饰得到的,序列为CH3CO-YKPVTNF-CONH2;寡聚化RIP-V分子得到RIP1182,同时进行乙酰化修饰得到的RIP1181,序列分别为YKPVTNF-ST-YKPVTNF-CONH2和CH3CO-YKPVTNF-ST-YKPVTNF-CONH2。反向高效液相色谱(RP-HPLC)法鉴定RIP衍生物的纯度均在95%以上;质谱鉴定RIP衍生物的分子量与理论值一致,表明所有合成的RIP衍生物结构正确。2.体内筛选RIP衍生物用HA-MRSA感染小鼠建立脓毒症模型,发现RIP-V显著提高小鼠生存率、减轻肺脏和肝脏病理损伤、减少小鼠脏器中细菌数,RIP-V体内抗感染活性优于RIP-I和RIP-L;RIP-V经末端修饰得到的RIP1183,RIP1183显著提高了脓毒症小鼠的生存率和延长生存时间,其抗菌活性优于RIP-V、RIP1181和RIP1182。结果显示设计合成的RIP衍生物中,RIP1183具有良好抗菌活性。3.RIP1183体外无抗菌作用RIP1183对6株葡萄球菌的MIC值均大于256μg/ml;RIP1183在250-1000μg/ml浓度下,均不能抑制6株葡萄球菌的生长,表明RIP1183体外无抗菌活性。4.RIP1183对MRSA感染小鼠保护作用在HA-MRSA(MRSA XJ75302)和CA-MRSA LAC感染所致脓毒症小鼠模型上,RIP1183分别提高小鼠的生存率达40%和60%,显著降低感染小鼠脏器中的细菌数量,减轻了小鼠脏器的病理损伤;在坏死性肺炎小鼠模型上,RIP1183可以显著降低感染小鼠肺脏的细菌数量,减轻肺水肿和肺病理损伤;皮肤感染模型上,RIP1183显著减少小鼠脓肿的形成,降低感染部位的细菌数量,并促进感染部位创面愈合。5.RIP1183体内抗菌机理探讨(1)RIP1183对中性粒细胞缺失的脓毒症小鼠保护作用消失。(2)RIP1183与中性粒细胞共孵育,不影响中性粒细胞内MPO活性(3)RIP1183可显著降低感染小鼠组织内细菌的RNAⅢ和PSMα、PSMβ等多种毒力因子的表达。(4)细菌LAC分泌上清中的PSM可以诱导中性粒细胞坏死性凋亡特征蛋白p MLKL表达增高,并能够被MLKL抑制剂NSA阻断。(5)与野生菌LAC比较,PSMα和PSMβ缺陷菌上清,降低中性粒细胞的p MLKL表达。(6)PSM多肽分子与中性粒细胞共孵育,PSM增加中性粒细胞中的p MLKL表达水平,并可以被NSA阻断;透射电镜从形态上直接观察到PSMα1可诱导中性粒细胞出现典型的坏死性凋亡特征,且NSA可显著减少坏死性凋亡的中性粒细胞的数目。(7)小鼠给予RIP1183或坏死性凋亡抑制剂Nec或缺失细菌PSM后,免疫荧光结果表明,小鼠肺组织中坏死性凋亡的中性粒细胞显著减少;Western blot结果表明,肺泡灌洗液中中性粒细胞的p MLKL表达水平降低了;流式细胞结果表明,坏死性凋亡的中性粒细胞比例降低。(8)小鼠给予RIP1183或坏死性凋亡抑制剂Nec或缺失细菌PSM后,可以显著提高肺炎小鼠生存率、促进肺脏内细菌的清除和减轻肺病理损伤。6.RIP1183安全性与药物代谢动力学研究(1)大鼠和比格犬分别静脉注射100 mg/kg和50 mg/kg的RIP1183后,未观察到任何毒性反应,该剂量分别为RIP1183有效剂量的28和48倍。(2)在治疗范围内,RIP1183对小鼠中枢系统、比格犬的呼吸系统和心血管系统无明显影响。(3)体内药代动力学实验结果表明,RIP1183在犬体内的血浆消除半衰期在20min左右。结论:1.筛选获得agr系统抑制剂RIP1183,并证实RIP1183是一种安全范围较大,毒性低,抗MRSA活性较优的抗菌剂,犬体内的血浆消除半衰期在20 min左右。2.发现RIP1183能够显著抑制MRSA的RNAⅢ和PSMα、PSMβ等多种毒力因子的表达。3.发现RIP1183体内抗菌作用依赖于白细胞功能的正常,中性粒细胞缺失后,RIP1183对脓毒症的保护作用消失,但是RIP1183无直接激活中性粒细胞的作用。4.提出RIP1183体内抗菌作用机理的假说,即RIP1183通过抑制金黄色葡萄球菌agr群体感应系统,抑制致病毒力因子的表达,减轻病毒力因子所致机体病理损伤;又通过抑制PSMα和PSMβ毒力因子表达,减轻这些毒力因子诱导的中性粒细胞坏死性凋亡,保护中性粒细胞清除细菌的功能。