研究背景及目的EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是1964年Epstein和Barr在研究非洲儿童的恶性淋巴瘤时,从瘤细胞培养中发现的一种嗜人类B淋巴细胞的γ疱疹病毒,基因组全长184kb。EB病毒在人群中的感染率达到90%以上,并与多种人类疾病相关,包括传染性单核细胞增多症、EB病毒相关淋巴细胞增生性噬血综合征、慢性活动性EB病毒感染、EB病毒相关性免疫缺陷病及EB病毒感染相关性肿瘤(如鼻咽癌、胃癌、伯基特淋巴瘤、T/NK细胞淋巴瘤等)等。其中,鼻咽癌是第一个被发现与EB病毒感染有关的人类癌症,且研究证实95%以上未分化型鼻咽癌组织中均可检测出EBV感染。自外国医学研究人员0ld LJ等报告使用免疫扩散实验确认EB病毒与鼻咽癌的血清学有关以来,国内外对EB病毒作了大量研究均发现抗EB病毒抗原的免疫球蛋白对鼻咽癌诊断有特异性。EB病毒感染机体后以两种状态存在：①潜伏期：此期病毒不进行复制,细胞主要合成核心抗原(Epstein-Barr virus associated nuclear antigen, EBNA)和潜伏膜蛋白(latent membrane protein, LMP);②裂解期：此期病毒基因完全表达,合成的病毒蛋白分为立早蛋白(zta)、早期蛋白(earlyintracellular antigen, EA)、衣壳抗原(Epstein-Barr virus capsid antigen, VCA)和晚期蛋白,在NPC患者中可检测到上述抗原的相应抗体。EBNA1是在EBV感染细胞早期出现的抗原,它的作用主要是调节EBV基因的复制,增强病毒基因的转录,维持病毒附加子的存在；另外也可与EBV潜伏感染时的复制起始点中的重复序列家族结合,激活LMP1的启动子,促进其转录。它会持续存在于病毒复制周期的最后阶段,已有报道EBNA1在检测鼻咽癌方面的灵敏度和特异度分别是91.9%和91.4%,且认为EBNA1是检测鼻咽癌的一个理想指标。目前,临床中常用的EBNA1 IgA检测试剂主要是进口及国产的ELISA检测试剂,它较细胞涂片方法简单、快捷、检验结果易判断。但依然存在一些不足：灵敏度、重复性不好；酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响,导致稳定性不好。本研究中我们采用时间分辨荧光免疫分析技术研制EBNA1 IgA检测试剂。TRFIA具有灵敏度高,检测范围宽,荧光寿命长,Stoke位移大,容易自动化,不易受干扰,无放射性同位素污染的特点,它可替代酶免法用于临床诊断。另外,因TRFIA法具有标准曲线范围宽、应用范围广泛、重复性好等优点,在下一步研制EB病毒NA1 IgA时间分辨荧光免疫分析法定量检测试剂盒较其他方法具有明显优势。Zta是EBV最重要的立早蛋白之一,被认为是EBV由潜伏期进入裂解期的开关分子。Zta作为EBV的重要转录因子,通过启动一系列早期和晚期蛋白的瀑布式转录表达,导致EBV由潜伏期进入裂解期。在20世纪90年代已有研究发现可通过检测EB病毒Zta抗体辅助诊断鼻咽癌,近几年国内也有一些研究评价EB病毒Zta抗体用于辅助诊断鼻咽癌的准确性,证实EB病毒Zta抗体检测用于鼻咽癌诊断的准确性较高,特别是在鼻咽癌筛查中有很高的特异度,具有较高的诊断价值和应用前景。加强研制开发检测该蛋白体外诊断试剂盒是临床医生和诊断试剂厂家关注的重点,但是目前检测领域己注册的仅有一个商品化的产品,应用时间分辨免疫分析技术检测EB病毒Zta抗体目前尚未见报道。本研究采用时间分辨荧光免疫分析技术研制EB病毒NA1 IgA、Zta IgA检测试剂,通过评价各项性能指标,并与其他检测试剂盒进行比较,评价其在临床检测应用中的可行性。方法：(一)EB病毒NA1 IgA时间分辨荧光免疫分析检测试剂1.1 EB病毒NA1 IgA时间分辨荧光免疫分析检测试剂的工艺优化。1.1.1采用间接法研制EB病毒NA1 IgA时间分辨荧光免疫分析检测试剂。1.1.2配置NA1 IgA阴性对照品、阳性对照品：阴性对照品用稀释缓冲液稀释抗EB病毒核抗原(NA1) IgA抗体ELISA检测阴性的正常人血清；阳性对照品用稀释缓冲液稀释抗EB病毒核抗原(NA1) IgA抗体ELISA检测为阳性的血清。1.1.3铕标记抗体与纯化：将0.5mg抗人IgA抗体加入50KD的蛋白超滤离心柱中,用标记缓冲液重复洗涤,9000r/min离心,每次6min,共6次。纯化抗体后,按质量比5：1的比例加入铕标记配体,标记体系为200 u L,将待标记抗体与铕标记试剂充分混匀后置于摇床25℃震荡过夜,次日过分子筛层析纯化,收集洗脱液,1mL/管,逐管测荧光值,合并高值的洗脱液,并用BCA法检测收集的洗脱液的终浓度,最后加入0.1%浓度的BSA作保护剂,-20℃保存。1.1.4包被浓度的确定：为确定最佳的NAl抗原的包被浓度,我们选取了0.5 ug/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、 2g/mL、2.5μg/mL、3μg/mL、4μg/mL七个不同的包被浓度梯度。在不同的包被浓度下,观察所选的阴性样本、阳性样本及阴性对照和阳性对照的荧光值,以荧光值趋于稳定为最佳的包被浓度。1.1.5铕标稀释比的确定：用稀释液将标记抗体分别稀释成1：400、1：600、1：800、1：1000、1：2000、1：4000、1：6000七个不同的稀释比。不同的铕标记抗体稀释比下,观察所选阴性样本、阳性样本及阴性对照和阳性对照的荧光值变化,在本底较低的情况下,取阳性样本和阴性样本的荧光值比值高,区别比较大的为最佳稀释比。1.1.6反应时间的确定：在其他反应条件确定的前提下,我们分别设定15min、 30min、45min、60min、90min、120min六个反应时间,观察所选样本及阴性对照和阳性对照荧光值随着反应时间增加所发生的变化,以荧光值趋于平衡的时间作为体系的最佳反应时间。1.2 EB病毒NA1 IgA时间分辨荧光免疫分析检测试剂的分析性能评价1.2.1精密度实验：重复测定三个不同样本(S1、S2、S3)的荧光值,得到每个样本的均值、标准差,计算分析内和分析间变异系数。1.2.2特异性实验：巨细胞病毒阳性样本,单纯疱疹病毒Ⅰ型阳性样本,单纯疱疹病毒Ⅱ型阳性样本,乙型肝炎阳性样本,丙型肝炎阳性样本各十例,以自制试剂检测上述血清,观察其检测结果,评价检测的交叉反应性。1.2.3抗干扰性分析：阴性对照、阳性对照中加入一定量的甘油三酯、血红蛋白和胆红素,对其进行测定,计算平均值。1.3试剂盒临床性能评估1.3.1 参考值的确定：以自制的EB病毒NA1 IgA时间分辨荧光免疫分析试剂盒检测420份健康人血清,统计血清荧光值的分布情况,计算样本荧光值与阴性对照的比值。取涵盖99%以上正常样本的界值,初步确定为试剂盒的正常人参考值,再结合ROC曲线最终确定参考值范围。1.3.2与对照试剂盒ELISA的比较试验：用自制试剂盒和对照试剂盒同时对509份血清样本进行检测,对其阴性符合率和阳性符合率进行比较。(二)EB病毒Zta IgA时间分辨荧光免疫分析检测试剂2.1EB病毒Zta IgA时间分辨荧光免疫分析检测试剂的工艺优化。2.1.1采用间接法研制EB病毒Zta IgA时间分辨荧光免疫分析检测试剂。2.1.2配置Zta IgA阴性对照品、阳性对照品：阴性对照品用稀释缓冲液稀释抗EB病毒Zta蛋白IgA抗体ELISA检测阴性的正常人血清；阳性对照品用稀释缓冲液稀释抗EB病毒Zta蛋白IgA抗体ELISA检测为阳性的血清。2.1.3铕标记抗体与纯化：将0.5mg抗人IgA抗体加入50KD的蛋白超滤离心柱中,用标记缓冲液重复洗涤,9000r/min离心,每次6min,共6次。纯化抗体后,按质量比5：1的比例加入铕标记配体,标记体系为200μ L,将待标记抗体与铕标记试剂充分混匀后置于摇床,25℃震荡过夜,次日过分子筛层析纯化,收集洗脱液,1mL/管,逐管测荧光值,合并高值的洗脱液,并用BCA法检测收集的洗脱液的终浓度,最后加入1‰浓度的BSA作保护剂,-20℃保存。2.1.4包被浓度的确定：为确定最佳的Zta抗原的包被浓度,我们选取了0.5 μg/mL,1μg/mL、μ1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL、3μg/mL、4μg/mL七个不同的包被浓度梯度。在不同的包被浓度下,观察所选的阴性样本、阳性样本及阴性对照和阳性对照的荧光值,以荧光值趋于稳定时选其为最佳的包被浓度。2.1.5铕标稀释比的确定：用稀释液将标记抗体分别稀释成1：400、1：600、1：800、1：1000、1：2000、1：4000、1：6000七个不同的稀释比。不同的铕标记抗体稀释比下,观察所选阴性样本、阳性样本及阴性对照和阳性对照的荧光值变化,在本底较低的前提下,取阳性样本荧光值和阴性样本荧光值比值高,区别比较大的为最佳稀释比。2.1.6反应时间的确定：在其他反应条件确定的前提下,我们分别设定30min、 45min、60min、90min、120min五个反应时间,观察所选样本及阴性对照和阳性对照荧光值随着反应时间增加所发生的变化,以荧光值趋于平衡的时间作为体系的最佳反应时间。2.2 EB病毒Zta IgA时间分辨荧光免疫分析检测试剂的分析性能评价2.2.1精密度实验：重复测定三个不同样本(Sl、S2、S3)的荧光值,得到每个样本的均值、标准差,计算分析内和分析间变异系数。2.2.2特异性实验：巨细胞病毒阳性样本,单纯疱疹病毒工型阳性样本,单纯疱疹病毒II型阳性样本,乙型肝炎阳性样本,丙型肝炎阳性样本各十例,以自制试剂检测上述血清,观察测定的阴阳性情况,评价检测的交叉反应性。2.2.3抗干扰性分析：阴性对照、阳性对照中加入一定量的甘油三酯、血红蛋白和胆红素,对其进行测定,判断干扰情况。2.3试剂盒临床性能评估2.3.1参考值范围：以自制的EB病毒Zta蛋白IgA时间分辨荧光免疫分析试剂盒检测445份健康人血清,统计血清荧光值的分布情况,计算样本荧光值与阴性对照的比值。取涵盖99%正常样本的界值,初步确定为试剂盒的正常人参考值,再结合ROC曲线最终确定参考值范围。2.3.2与对照试剂盒的比较：样本用自制试剂盒和对照试剂盒同时对501份样本进行检测,对其阴性符合率和阳性符合率进行比较。结果：(一) EB病毒NAl IgA时间分辨荧光免疫分析检测试剂NA1抗原包被浓度确定为2.5μg/mL,铕标记抗体稀释比例为1：2000,反应时间确定为60min。420份健康人血清测试结果显示,当样本荧光值与阴性对照比值在2.7时,包含了99%以上的样本；ROC曲线表明,当比值在2.7时,敏感度为97.7%,特异性为95.5%；据此设定本试剂盒的EBNAl IgA抗体的cutoff值=阴性对照荧光值×2.7。分析内和分析间精密度分别为1.56-4.99%和3.92-6.95%;与CMV、HSV Ⅰ型、HSV Ⅱ型、HBV、HCV无交叉反应。干扰性实验表明自制试剂盒不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。与中山生物公司研制的EB病毒核抗原(NA1) IgA抗体ELISA试剂盒比较,本试剂盒检测的结果与中山生物公司的试剂盒检测结果高度一致,说明本试剂能够满足临床检测的要求。(二) EB病毒Zta IgA时间分辨荧光免疫分析检测试剂Zta抗原包被浓度确定为2.0μg/mL,铕标记抗体稀释比例为1：1000,反应时间确定为60min。445份健康人血清测试结果显示,当样本荧光值与阴性对照比值在3.1时,包含了99%以上的样本；ROC曲线表明,当比值在3.1时,敏感度为99.2%,特异性为93.6%；据此设定本试剂盒的Zta IgA抗体的cutoff值=阴性对照荧光值×3.1。分析内和分析间精密度分别为2.45%-3.69%和3.80%-4.80%；与巨细胞病毒,单纯疱疹病毒Ⅰ型,单纯疱疹病毒Ⅱ型,乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒无交叉反应。干扰性实验表明自制试剂盒不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。与中山生物公司研制的EB病毒Zta蛋白IgA抗体ELISA试剂盒比较,对501份临床样本进行分析比较,本试剂盒检测的结果与中山生物公司的试剂盒检测结果高度一致,说明本试剂能够满足临床检测的要求。结论：以上结果表明,本研究研制的EB病毒核抗原(NA1)IgA、Zta IgA时间分辨荧光免疫分析检测试剂的各项指标(精密度、特异性、干扰性等)均达到临床检测试剂要求,有望广泛应用于临床样本的检测。