研究背景：水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一组介导水分子跨膜转运的细胞膜蛋白,AQP4被认为是脑内最重要的AQP亚型,主要表达在包绕脑微血管及蛛网膜的星形胶质细胞足突膜上,而在非足突的胞体表面表达较少,与其调节水平衡的功能一致。已经发现,脑外伤、脑缺血、脑肿瘤等多种脑损伤病理中,伴随脑内AQP4表达上调；对AQP4基因敲除动物的研究结果提示,AQP4对血管性脑水肿和细胞性脑水肿的形成均有影响。但是,除了调节水平衡外,AQP4还影响星形胶质细胞的生长及其他功能,参与非水肿性疾病(如炎症、兴奋性氨基酸毒性等)的病理过程。脑损伤是高度复杂的病理过程,可诱发一系列细胞及分子事件。在脑损伤的急性期(数小时到数天),由于代谢紊乱和兴奋性毒性导致神经元损伤；在亚急性期(数天到数周),主要病变为炎症反应和细胞死亡；在慢性期(数周以后),主要为组织修复等变化。脑损伤中,小胶质细胞和星形胶质细胞起重要作用。小胶质细胞是脑内重要的炎症细胞,小胶质细胞激活后对于脑损伤后炎症反应以及慢性神经功能恢复有重要的影响。脑损伤周边区的星形胶质细胞反应性增生,最终导致胶质疤痕的形成,胶质疤痕一方面可以限制病变扩散,但又阻碍神经生长。脑损伤后继发的炎症是影响病变程度和恢复的主要因素之一,受许多炎症因子、炎症介质的调节。半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes, CysLTs)是一类重要的炎症介质,在脑缺血、脑外伤等中枢神经系统损伤性疾病发病中起重要作用。CysLTs主要通过半胱氨酰白三烯受体(cysteinyl leukotriene receptor, CysLT受体)起作用,该类受体主要包括CysLT1和CysLT2受体两种亚型。药理学表明, CysLT1受体参与脑缺血后急性期神经元损伤和慢性期胶质增生过程,可诱导血脑屏障通透性增加而参与缺血后炎症,并能介导粘附因子等的表达；CysLT2受体介导整体和离体水平缺血性损伤后小胶质细胞的激活和吞噬。在AQP4基因敲除小鼠,对脑缺血等损失后脑水肿变化有较多研究,但是,对于不同类型脑损伤以及炎症有什么改变,尚无系统研究,尤其需要阐明脑损伤后炎症变化特点。由于AQP4基因敲除可影响星形胶质细胞功能,由此造成一些非水肿性变化,本研究主要关注这些方面的变化。研究目的：本文采用AQP4基因敲除(AQP4-/-)小鼠,观察不同类型脑损伤模型中AQP4起的作用,拟做以下4个方面的研究：1.阐明局灶性脑缺血后脑内炎症变化特点,观察缺血损伤后24 h和72 h炎症细胞和炎症相关的半胱氨酰白三烯受体,以及其他损伤变化。2.阐明局灶性脑缺血慢性损伤过程及慢性期改变,观察缺血损伤后35天内的生存率变化,神经症状以及神经元密度和星形胶质细胞反应性增生的变化。3.阐明脑冰冻伤后损伤特点,观察损伤后24 h,7天和14天损伤面积和神经元密度等变化,以及小胶质细胞反应和星形胶质细胞的胶质疤痕形成特点。4.阐明兴奋性氨基酸毒性的变化特点,建立NMDA皮层注射模型,观察损伤后24 h的损伤面积和神经元密度以及血脑屏障通透性的的变化。研究方法：以线栓法制备左侧大脑中动脉阻塞(MCAO),诱导小鼠局灶性脑缺血模型；以改良的颅骨外冰冻法技术建立不同时间点的冰冻伤模型；以大脑皮层微注射技术,建立NMDA诱导脑兴奋性毒性损伤模型。以冰冻切片甲苯胺蓝染色法检测脑损伤面积；以冰冻切片IgG免疫组织化学检测法观察血脑屏障通透性的变化；以冰冻切片免疫荧光组织化学法,观察存活神经元、小胶质细胞、中性粒细胞和星形胶质细胞的的变化；以Fluoro-Jade B染色法观察坏死神经元变化；以免疫印迹法观察局灶性脑缺血损伤急性期半胱氨酰白三烯受体的表达特点；免疫荧光共染色法观察半胱氨酰白三烯受体在脑内的细胞分布。研究结果：1.AQP4缺失加重脑缺血急性损伤及炎症反应与野生型小鼠比较,AQP4-/-小鼠局灶性缺血损伤后24 h和72 h,周边区的神经元密度缺失程度增加；缺血后24 h和72 h中心区中性粒细胞浸润加重；周边区阿米巴样小胶质细胞活化和增殖增多,但杆状小胶质细胞的密度减少；同时,在72 h周边区星形胶质细胞反应性增生和聚集减弱。AQP4-/-小鼠缺血侧脑组织在缺血后24 h和72 h,炎症介质受体一半胱氨酰白三烯受体(CysLT1和CysLT2受体)蛋白表达增加；在两种小鼠大脑中,CysLT1和CysLT2受体蛋白细胞定位模式一致,在损伤中心区都表达于损伤的神经元和中性粒细胞,在周边区都表达于活化的小胶质细胞,但都不表达于星形胶质细胞。这些结果提示,AQP4缺失加重急性脑缺血损伤期,加重炎症反应,该变化可能与AQP4-/-小鼠星形胶质细胞功能减弱,限制炎症的能力下降有关。2.AQP4缺失加重脑缺血慢性损伤与野生型小鼠比较,AQP4-/-小鼠局灶性脑缺血损伤后35天内的生存率降低,术后的体重恢复减慢,术后神经症状的恢复减轻；加重脑萎缩体积和脑内空洞的形成；并且,抑制损伤周边区星形胶质细胞的反应性增生和聚集,减弱胶质疤痕的生成。这些结果提示,AQP4-/-小鼠脑损伤慢性期症状加重,可能与脑内胶质疤痕形成功能减弱,不利于局部限制损伤病灶扩展有关。3.AQP4缺失减轻脑冰冻伤急性损伤但加重后期损伤与野生型小鼠比较,AQP4-/-小鼠冰冻伤24 h脑损伤面积和脑表面出血均明显减轻；但是,14天的损伤面积增加。损伤周边区的神经元密度变化与损伤面积类似,与野生型小鼠比较,AQP4-/-小鼠损伤周边区在24 h的存活神经元密度明显较高,但在7天和14天,则密度明显降低。同时,AQP4-/-小鼠小胶质细胞数量在急性期并没有明显的增加或减少,但是,在损伤7天和14天,较野生型小鼠明显增加。AQP44-小鼠星形胶质细胞密度在7天和14天都明显减少。结果提示,AQP4基因缺失减轻小鼠脑冰冻伤急性损伤,但是加重延迟性损伤,可能与损伤后期小胶质细胞增生加重有关。4.AQP4缺失加重兴奋性氨基酸诱导的损伤小鼠皮层注射NMDA 150nmol后24 h,可导致皮层损伤、神经元变性及血脑屏障通透性增高。与野生型小鼠相比,AQP4-/-小鼠的损伤变化明显增强。结果提示,AQP4可能抑制NMDA诱导的急性脑损伤,增加损伤区Fluoro-Jade B阳性的变性神经元密度,并且,与抑制血脑屏障通透性增高有关。结果提示,AQP4在NMDA诱导的脑损伤中可能起保护作用。结论：1.在局灶性脑缺血损伤模型中,AQP4基因缺失可加重缺血性脑损伤。缺血急性期小胶质细胞和中性粒细胞聚集增加,诱导炎症相关的半胱氨酰白三烯受体表达。慢性期加重死亡率,减慢小鼠体重增长,加重脑萎缩体积和脑内空洞形成。这些变化可能与AQP4基因缺失减弱星形胶质细胞细胞增生和聚集,减弱胶质疤痕的生成有关。2.在脑冰冻伤中,AQP4基因缺失小鼠在早期脑表面出血和脑损伤面积减轻；但后期脑损伤加重,这可能与减弱星形胶质细胞反应性增生,妨碍胶质疤痕生成有关。3.在兴奋性氨基酸损伤模型中,AQP4基因缺失加重损伤,加重神经元坏死,这可能与加重血脑屏障通透性的增加有关。4.综合以上结果,AQP4基因缺失造成星形胶质细胞反应能力降低,使其限制炎症等损伤反应的作用减弱,可能是损伤增强的原因；换言之,AQP4是维持星形胶质细胞功能抑制损伤反应的一个因素。