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背景：CD8+T细胞在清除胞内感染的病原时发挥重要作用，基于T淋巴细胞所介导的细胞免疫进行免疫接种，逐渐受到免疫学家们的关注。然而，目前我们对于CD8+T细胞效应与记忆分化的调节机制还知之甚少。 机体感染病毒或胞内菌时，T细胞反应会经历三个特征明显的阶段：克隆扩增期，T细胞收缩期和记忆细胞形成期。抗原特异性初始CD8+T细胞在接触相应抗原后活化扩增为效应CD8+T细胞，同时会分化为具有不同功能和表型的细胞亚群，主要有以 KLRG1hiCD127low为标记的短时效应细胞和以 KLRG1lowCD127hi为标记的记忆前体效应细胞。短时效应细胞为终末分化的细胞，在感染清除后死亡。记忆前体效应细胞中的一部分可以存活下来成为记忆性T细胞，其中中心记忆性T细胞可以在体内维持稳定的自我更新。机体再次感染相同抗原时，中心记忆性T细胞可以快速扩增、分化产生大量效应T细胞，迅速清除病原。 CD8+T细胞活化为效应细胞、分化产生记忆细胞的过程中受到许多转录因子的调节。转录因子T-bet、Eomes、Bcl6、Blimp1和Tcf1在CD8+T细胞效应与记忆中的作用已有报道。Best JA等对CD8+效应T细胞及记忆T细胞，进行了基因表达谱的高通量分析，发现更多 CD8+T细胞活化与分化中可能涉及的转录因子。其中，TGF-β信号通路的关键下游分子Smad4，可能参与CD8+T细胞的活化与分化。Smad4在T细胞中的具体作用及机制还未见文献报道。 本研究使用T细胞中特异性敲除Smad4的Smad4fl/fl;Lck-Cre（Smad4-/-）小鼠及对照小鼠（Smad4fl/fl），以尾静脉注射 OVA修饰的李斯特菌（LM-OVA）为感染工具，用以活化抗原特异性Kb-ova+CD8+T细胞，探究Smad4在CD8+T细胞效应与记忆中的作用。LM-OVA在小鼠中的主要感染部位是小鼠脾、其次是小鼠肝。 目的：探究Smad4在CD8+T细胞效应与记忆中的作用，并揭示Smad4缺失造成CD8+T细胞效应与分化异常的机制。 方法和结果： 1）通过检测初次感染LM-OVA7d时小鼠脾Kb-ova+CD8+T中CD44、CD43、CD62L、CD27等分子的表达，探究Smad4缺失对CD8+T细胞活化的影响。通过检测初次感染LM-OVA7d时小鼠脾中Kb-ova+CD8+T的比例、数量和增殖情况，探究Smad4缺失对CD8+T细胞扩增的影响。结果显示Smad4缺失小鼠中抗原特异性CD8+T细胞的活化、增殖情况与对照小鼠相比，没有明显差异。 2）通过检测初次感染35d时，小鼠脾中Kb-ova+CD8+T的比例、数量，探究Smad4缺失对记忆性 CD8+T细胞数量的影响。结果显示 Smad4缺失小鼠中记忆CD8+T细胞的比例和数量与对照相比没有明显差异。 3）通过检测再次感染5d时，小鼠脾Kb-ova+CD8+T中CD44、CD43、CD62L、CD27等分子的表达及Kb-ova+CD8+T比例和数量，探究Smad4缺失对记忆性CD8+T细胞活化与扩增的影响。结果显示Smad4缺失小鼠中记忆CD8+T细胞的活化和克隆扩增与对照相比没有明显差异。 4）Granzyme B、IFN-γ、TNF-α是效应CD8+T细胞发挥杀伤作用的重要效应分子。通过检测初次感染7d和再次感染5d时，小鼠脾Kb-ova+ CD8+T细胞中Granzyme B、IFN-γ、TNF-α的表达比例和平均荧光强度，探究 Smad4缺失对CD8+T细胞效应分子产生的影响。结果显示Smad4缺失小鼠脾中产生Granzyme B的Kb-OVA+CD8+T细胞比例与对照相比明显减少，而产生IFN-γ和TNF-α的细胞比例与对照相比没有明显差异。Granzyme B、IFN-γ、TNF-α阳性细胞的平均荧光强度与对照相比均没有明显差异。通过将效应CD8+T细胞与OVA修饰的El4细胞共孵育，进行效应CD8+T细胞体外杀伤实验，探究Smad4缺失对效应CD8+T细胞体外杀伤活性的影响。结果显示Smad4缺失后效应CD8+T细胞对靶细胞的杀伤作用减弱。通过肝脏载菌量实验，探究Smad4缺失对效应CD8+T细胞清除胞内病原能力的影响。结果显示Smad4缺失小鼠肝脏载菌量较对照相比明显增加。这些结果表明Smad4缺失导致效应CD8+T细胞的杀伤活性减弱。 5）通过检测初次感染7d和再次感染5d时，小鼠脾Kb-ova+CD8+T中KLRG1、CD127的表达，探究Smad4缺失对CD8+T分化的影响。结果显示Smad4缺失小鼠抗原特异性 CD8+T细胞中的KLRG1hiCD127low的比例较对照相比明显减少，而KLRG1lowCD127hi的细胞比例显著增加，即短时效应细胞（SLECs）比例减少，记忆前体效应细胞（MPECs）比例增加。通过检测初次感染7d，小鼠脾Kb-ova+ CD8+T中效应与记忆相关转录因子的mRNA和蛋白表达，探究Smad4缺失是否影响效应与记忆相关因子的表达。结果显示Smad4缺失导致效应相关分子T-bet、Blimp1表达减少，而记忆相关分子Tcf1、Bcl6、Eomes表达增加。 6）Smad4-/-小鼠中CD4+、CD8+T细胞中都缺失Smad4表达，而CD4+T细胞在CD8+T细胞的活化和记忆中具有辅助作用。通过对Th和Treg细胞比例进行分析，发现Smad4-/-小鼠与对照小鼠脾中Th1、Th2、Th17和Treg的表达没有差异。但由于CD8+T细胞还可能受炎性细胞因子或其他因素的影响，为进一步探究Smad4缺失导致的CD8+T细胞效应与记忆异常，是CD8+T细胞内源性的缺陷，还是外界因素引起，进行CD8+T细胞体外活化实验和骨髓嵌合体小鼠竞争实验。结果显示CD8+T细胞体外活化时，Smad4缺失对CD8+T细胞的活化没有影响，表达Granzyme B的细胞比例减少。在骨髓嵌合体小鼠中，Smad4缺失导致产生Granzyme B的效应CD8+T细胞比例减少、记忆前体效应细胞增加、短时效应细胞减少等现象依然存在。此外在骨髓嵌合体小鼠中，初次感染后35d Smad4-/-小鼠来源的Kb-ova+CD8+T细胞比例明显低于来源于对照小鼠的Kb-ova+CD8+T细胞。Smad4缺失导致的CD8+T细胞效应与分化异常为CD8+T细胞内源性缺陷，并提示Smad4缺失导致CD8+T细胞具有内源性的记忆缺陷。 7）通过检测初次感染35d时，小鼠脾Kb-ova+CD8+T细胞中CD62L和CD27的表达，探究Smad4缺失对中心记忆性CD8+T细胞数量的影响。结果显示Smad4缺失小鼠记忆CD8+T细胞中，CD62Lhi中心记忆型CD8+T细胞比例较对照相比明显减少，但CD27hi中心记忆型CD8+T细胞比例没有明显异常。进一步检测初次感染后10d、21d时Kb-OVA+CD8+记忆前体效应细胞中CD62Lhi细胞比例，探究Smad4缺失导致的中心记忆性CD8+T细胞减少从何时开始发生。结果显示初次感染10d时， Smad4缺失小鼠中心记忆性CD8+T细胞比例与对照相比没有明显差异，但感染21d时，Smad4缺失小鼠中心记忆性CD8+T细胞比例与对照相比已明显减少。通过检测不同时间点小鼠脾中记忆前体效应细胞的增殖和凋亡，探究Smad4缺失对记忆性CD8+T细胞产生与存活的影响。结果表明Smad4缺失后记忆性CD8+T细胞的增殖没有缺陷，但Smad4缺失导致记忆前体效应细胞的凋亡增加，记忆细胞存在存活缺陷。 结论：Smad4缺失不影响CD8+T细胞的活化和克隆扩增，但Smad4缺失会导致分泌杀伤效应因子Granzyme B的抗原特异性CD8+T细胞比例减少，体内外杀伤效应减弱，Smad4具有促进效应 CD8+T细胞发挥杀伤功能的作用。效应 CD8+T细胞分化过程中，Smad4通过调节效应与记忆相关因子的表达，促进短时效应细胞生成而抑制记忆前体效应细胞产生。尽管Smad4抑制记忆前体效应细胞的产生，但Smad4在中心记忆性CD8+T细胞的存活和维持中仍不可或缺。 Smad4具有促进CD8+T细胞发挥效应功能和稳定记忆细胞存活的作用。调节Smad4的表达可能会为免疫接种、癌症和自身免疫病的防治提供一些新的思路。