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目的:了解贵阳地区耐多药结核分枝杆菌rpo B基因、kat G基因、inh A启动子和oxy R-aphc间隔区基因突变特征,为耐药基因芯片法检测的完善和推广应用提供实验依据;应用分枝杆菌散在重复单位分型法(Mycobacterial interspersed repetitive units,MIRU)对86株结核分枝杆菌进行分子分型,了解本地结核分枝杆菌耐多药分子分型特征;比较MIRU12个位点对本地菌株进行分子分型的分辨率。方法:1、采用罗氏培养法从患者痰标本中分离培养结核分枝杆菌,以间接比例法检测结核分枝杆菌临床菌株对异烟肼、利福平的敏感性;2、提取结核分枝杆菌DNA,对31株结核分枝杆菌临床分离株(耐多药17株,敏感株14株)的rpo B基因、kat G基因、inh A启动子和oxy R-aphc间隔区进行DNA片段的PCR扩增,并进行测序分析;3、在Gen Bank中下载H37Rv的rpo B基因、kat G基因、inh A启动子和oxy R-aphc间隔区序列与氨基酸序列,采用CLC Free Workbench 4.5进行比对分析,了解本地区耐药相关rpo B基因、kat G基因、inh A启动子和oxy R-aphc间隔区基因突变的多样性;4、分别对86株结核分枝杆菌(耐多药菌株46株,敏感菌株40株)MIRU12个位点进行PCR扩增。扩增产物以2.0%琼脂糖凝胶进行电泳,使用100bp DNA Ladder做标志。应用凝胶成像仪分析扩增产物的大小,计算相应MIRU位点的拷贝数。选取部分菌株MIRU12个位点的PCR扩增产物进行测序,以在线重复序列分析软件对各序列分析散在分布重复单位拷贝数。5、利用NTsys2.10e软件对全部基因型数字化的结果行非加权组平均法(UPGMA)聚类分析。计算各MIRU位点分辨力大小。6、应用卡方检验检测年龄、性别及基因型与本地结核分枝杆菌耐多药相关性。结果:1、17株结核分枝杆菌耐多药菌株中有12株检出rpo B基因变异,其中7株为531位TCG→TTG变异,2株为CAC526TAC变异,ATC533TTC、ATC565TTC变异各1株,1株为CTG530ATG与TCG526TTC联合突变,5株耐多药菌株rpo B基因没有检出突变。敏感菌株均未检出变异。rpo B530和565变异位点存在于基因芯片法检测范围外。2、17株耐多药结核分枝杆菌中有16株检出kat G基因突变,其中70.5%(12/17)为315位密码子变异,且变异类型均为AGC→ACC,敏感株未发现315位点突变。11株敏感菌和4株耐药菌在kat G463位密码子发生变异,变异类型均为CGG→TGG,变异率分别为78.6%(11/14)和23.5%(4/17),敏感菌和耐药菌变异率相比,χ2值为6.28,P>0.05,差异无显著性。有12株耐药株的变异类型为kat G基因双重位点突变,其中10株为kat G315(AGC→ACC)和463(CGG→TGG)位变异,463(CGG→TGG)和299(GGC→AGC)变异及463(CGG→TGG)和419(GAC→CAC)位变异各1株。2株异烟肼耐药菌检出oxy R-aph C启动区G32A突变,其中1株为联合kat G463和299位突变。kat G299,419及oxy R-aph C-G32A位点变异在基因芯片检测法范围外。3、MIRU12位点法将86株结核分枝杆菌分为I,II,III,IV四个基因群,75个基因型,其中70个独立基因型。I群包含结核分枝杆菌64株,占全部菌株的74.40%,为本地的优势菌株。I群中耐多药结核分枝杆菌36株,敏感菌株28株。4、除70株独立基因型外的16株菌分型成5簇,最大簇包含5株菌,最小簇包含2株菌。成簇率为18.60%。5、12个MIRU位点中,位点26、31显示高等程度多态性(h>0.60),其中位点26显示多态性最高,h为0.704;位点3l,10,39,16,40,23,2显示中等程度的多态性(h≥0.30);位点4,20,27,24显示较低多态性(h<0.30);位点24只有一种等位基因型。6、经卡方检验,不同性别、年龄及基因型别菌株耐多药率经χ2检验,χ2值分别为6.48,6.48,10.23,P均大于0.05。结论:1、贵阳耐多药结核分枝杆菌利福平耐药基因突变主要的变异类型为rpo B531及rpo B526位点突变;2、贵阳耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变主要的变异类型为kat G315位点突变;3、贵阳耐多药结核分枝杆菌存在芯片(博奥生物有限公司)法检测不涵盖的耐药基因突变;4、贵阳市结核分枝杆菌具有遗传多样性,I群为本地结核分枝杆菌主要流行菌群;5、MIRU26,MIRU31在本地区结核分枝杆菌中分辨力较好,MIRU4,MIRU27,MIRU20,MIRU24分辨力较差;6、性别、年龄、基因型别均与本地区结核分枝杆菌耐多药性无关。