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研究背景、目的:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是目前国内乃至世界上最普遍的退行性关节疾病,是导致中老年人群致残的主要原因。迄今为止,由于对疾病发病机制及病因的了解不够,目前还没有治疗早期骨关节炎有效的对因治疗方法。因此,深入研究骨关节炎的病因及发病机制,进一步了解骨关节炎分子及调控机制与关节组织的关系,寻找新的治疗靶点,对于开发新的预防和治疗骨关节炎的治疗方法是意义重大的。促炎细胞因子白细胞介素1是早期骨关节炎分泌的重要炎症介质,IL-1β在OA发病中发挥重要作用,可以影响关节软骨细胞和软骨细胞外基质。IL-1β在软骨细胞和软骨中的病理作用是由于激活了多种促炎信号通路所引起的,其中核转录因子κB（NF-κB）信号通路是其中一条炎症经典信号通路。活化的NF-κB触发了骨关节炎相关炎性细胞因子及分解代谢因子基因的表达,并最终导致骨关节炎的发生。诺卡酮（Nootkatone,NTK）是倍半萜烯类化合物瓦伦西亚烯的酮类衍生物,其多种生物活性就被国内外学者进行着不断的研究和开发。目前,其抗炎特性尤为引起关注,最新的国外研究报道诺卡酮可以作用于NF-κB、p38MAPK、PI3K/Akt等多种信号通路,从而抑制IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS等炎性分解代谢因子的表达,而NF-κB信号通路又是骨关节炎的发病机制中分解代谢信号主要通路之一。因此,我们猜想诺卡酮在抑制骨关节炎的疾病进展方面也必然发挥着相当重要的作用。本研究中我们通过采用IL-1β诱导小鼠软骨细胞炎症损伤构建体外OA模型进行相关实验研究,来探究诺卡酮在体外OA模型中对炎症的调控作用,并通过构建ACLT诱导的小鼠体内OA模型进行相关实验研究,来探究诺卡酮对炎症在体内OA模型中的调控作用。最后,采用Western Blot技术检测NF-κB信号通路的活性,来探究诺卡酮在骨关节炎中抗炎的胞内信号通路机制。研究方法:在体外OA模型实验中,我们首先采用LAL内毒素法以及CCK8法检测来验证诺卡酮的生物相容性;然后,采用Griess法检测诺卡酮对IL-1β诱导软骨细胞产生的炎症介质NO含量的影响;分别采用QRT-PCR技术、Western Blot技术和ELISA技术来检测诺卡酮对IL-1β诱导软骨细胞产生的TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2、ADAMTS-5、MMP-13、Aggrecan及Collagen Ⅱ的表达水平的影响。在体内OA模型实验中,首先通过对小鼠膝关节实施前交叉韧带横断术（ACLT）构建小鼠膝关节OA模型并设置对照,诺卡酮（10mg/kg）给药6周后收集各组小鼠的膝关节,通过对小鼠关节软骨组织的处理及标本制作,完成了 HE及番红O-固绿染色等相关组织学分析。然后,分别采用QRT-PCR技术、Western Blot技术和免疫组化检测技术来检测诺卡酮对ACLT术后关节软骨内炎症介质COX-2、iNOS、IL-1β、TNF-α、IL-6及软骨细胞外基质降解酶ADAMTS-5、MMP-13的表达水平的影响。最后,我们在离体培养的小鼠软骨细胞中加入IL-1β诱导并给药诺卡酮干预,采用Western Blot技术检测诺卡酮对于NF-κB信号通路中标志性蛋白IκB-α、p65的蛋白表达水平及其磷酸化水平的影响。研究结果:体外OA模型实验:1.LAL及CCK8实验结果:在提取小鼠软骨细胞构建的体外OA模型中应用诺卡酮的工作药物浓度应在200μM以下,此时药物不会对小鼠软骨细胞产生毒性且药物的内毒素污染均低于0.01EU/mL,在小鼠软骨细胞中表现出生物相容性良好,可用于后续实验。2.Griess实验结果:IL-1β（10ng/mL）可明显刺激小鼠软骨细胞产生大量炎症介质NO,而给药工作浓度范围内的诺卡酮（10、50、100、200μM）可明显抑制小鼠软骨细胞对于NO的产生（P＜0.05）,并随诺卡酮浓度的增加其抑制细胞产生NO能力逐渐增强。3.QRT-PCR实验结果:诺卡酮能够显著抑制IL-1β诱导的小鼠软骨细胞产生的炎症介质TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2及软骨细胞外基质降解酶ADAMTS-5、MMP-13的基因表达水平（P＜0.05）。4.Western Blot及ELISA实验结果:诺卡酮能够显著抑制IL-1β诱导的小鼠软骨细胞产生的炎症介质TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2及软骨细胞外基质降解酶ADAMTS-5、MMP-13的蛋白表达水平,这与前述它对基因表达水平的影响是一致的。体内OA模型实验:1.小鼠膝关节组织学HE及番红O-固绿染色实验结果:通过对比分析首先证实了 ACLT诱导的小鼠体内OA模型术后软骨明显破坏,呈典型骨关节炎改变,验证了 ACLT诱导小鼠OA模型的构建成功;其次也证实了诺卡酮能够显著抑制ACLT手术引起的炎症反应,明显抑制软骨基质的降解,延缓了 OA的疾病进展。2.QRT-PCR实验结果:诺卡酮能够显著抑制ACLT诱导的小鼠体内OA模型的关节软骨产生的炎症介质iNOS、COX-2、IL-1β、TNF-α、IL-6和软骨细胞外基质降解酶ADAMTS-5、MMP-13的基因表达水平（P＜0.05）。3.免疫组化及Western Blot实验结果:诺卡酮能够显著抑制ACLT诱导的小鼠体内OA模型关节软骨产生的炎症介质iNOS、COX-2和软骨细胞外基质降解酶ADAMTS-5、MMP-13的蛋白表达水平。这与前述它对基因表达水平的影响是一致的。诺卡酮抗炎的胞内信号通路机制研究实验:诺卡酮能够显著抑制IL-1β诱导的小鼠软骨细胞内NF-κB信号通路中标志性蛋白IκB-α、p65的磷酸化水平。结论:诺卡酮在小鼠体内、外OA模型中能够显著抑制炎症介质和软骨基质降解酶的表达水平,可在体内、外发挥其抗炎及抑制软骨基质降解的调控作用。诺卡酮能够显著抑制小鼠软骨细胞胞内的NF-κB信号通路的活化,从而抑制多种炎症介质的表达,延缓骨关节炎的疾病进展。