肺癌在全球癌症发病率排第二位，是癌症相关死亡的首位原因。即使Ⅰ期或Ⅱ期的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的5年生存率仅为40～50％。性别、年龄、手术方式、肿瘤直径以及术后分级是肿瘤复发的重要因素，病理分期和组织学类型显著影响复发与生存率。　　趋化因子CCL20，也称巨噬细胞炎症蛋白-3α(macrophageinflammatory protein-3α，MIP-3α)，是已知唯一与CC趋化因子受体6(CCchemokine receptor6， CCR6)相互作用的细胞因子，与抗菌β-防御素(beta-defensins)属性相当。其配体受体对CCL20/CCR6化学性趋化未成熟的树突状细胞、效应/记忆T细胞和B细胞，在癌症和风湿性关节炎中起重要作用。　　近年来发现CCL20与肿瘤的进展和转移相关。趋化因子及其受体在多种细胞中表达，其中包括白细胞和肿瘤细胞。肿瘤细胞来源的趋化因子在特异性的募集白细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltratinglymphocyte，TIL)、巨噬细胞以及树突状细胞至肿瘤环境中起十分重要的作用。从而有助于增强特异性的宿主抗肿瘤免疫应答。有报道在结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、鼻咽癌及肝癌中有高水平的CCL20表达。有证据表明CCL20在多种类型癌症中促进肿瘤生长。不仅如此，CCL20参与了癌症发生、血管形成以及浸润。因此我们推测其与肺癌的发生与发展有关，进而影响肺癌的预后。　　丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要功能是将细胞外的调节信号传递到细胞核上，并参与细胞的生长、发育等生理过程，在恶性肿瘤细胞发生、浸润等方面也发挥着一定作用。其中细胞外信号调节激酶（etracellular signal-regulates kinase，ERK）是Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的重要组成，被激活后形成磷酸化ERK(phosphorylated extracellularsignal-regulates kinase，pERK)。近年研究结果发现，ERK的异常与肿瘤的发生发展有关。通过接受外界细胞趋化因子刺激，如CCL20、CCR6等，ERK被激活发生磷酸化，进入细胞核内，调节细胞生长及促进多种癌基因的转录与表达，并且破坏细胞外基质、促进肿瘤血管的发生，促使肿瘤细胞发生转移。　　我们的研究观察了趋化因子CCL20及其受体CCR6在非小细胞肺癌患者血清以及肺腺癌患者组织中的表达情况，并通过抑制ERK信号通路观察对趋化因子CCL20刺激肺腺癌A549细胞系克隆形成的影响，探讨趋化因子CCL20/CCR6和ERK信号通路在非小细胞肺癌根治术后复发和转移中的作用及机制。　　第一部分、血清趋化因子CCL20与非小细胞肺癌胸腔镜根治术后早期复发和转移相关性研究　　目的:通过检测非小细胞肺癌患者血清趋化因子CCL20水平，探讨CCL20作为非小细胞肺癌患者术后早期复发和转移预测指标的意义和可行性。　　方法:选取河北省人民医院2009年2月至2011年12月住院手术，术前评估为Ⅰ或Ⅱ期，并经术后病理证实为非小细胞肺癌患者239例。同时选取20名健康对照。所有肺癌患者均采用胸腔镜手术肺癌根治术。在239名患者中，有36名患者被剔除。其中4名患者因术中出血或纤维粘连改为开胸手术;3名患者支气管残端病理阳性;4名患者因淋巴结转移无法完全切除;4名患者胸膜转移;5名患者胸壁癌;8名患者严重并发症或死亡;8名患者失访。剩余203名术后组织病理为Ⅰ或Ⅱ期患者纳入本研究。术前及术后的组织病理分析根据国际抗癌联盟TNM分期系统进行，随访至术后两年。所有患者采用双腔气管插管和单肺通气，常规全身麻醉。采用胸腔镜手术步骤，分别在腋中线第7或第8肋间，腋前线第4或第5肋间，以及肩胛下线第8或第9肋间做切口以插入胸腔镜手术器械。标本袋收集病变样本。不切断肌肉（背阔肌及前锯肌）和肋骨。术中记录出血量(quantity ofhemorrhage，QOH)及手术时间(time of operation，TOP)。部分病变肺组织以10％福尔马林固定;其余病变肺组织迅速放入液氮，并转移到-80℃低温冰箱保存。收集患者术前当天及术后30、90、180天清晨血标本。同样收集健康人血标本。血标本静置、离心（3000 g，共10 min），分离血清，-80℃低温冰箱保存，采用酶联免疫吸附法检测血清CCL20的水平。部分患者在术后30天进行了辅助性化疗，根据此情况，将患者分为辅助性化疗组及非辅助性化疗组。根据术后180天中位数CCL20水平将患者分为高水平组及低水平组。根据不同复发或转移部位分组，分为肺转移、淋巴结转移、脑转移、骨转移、肝转移、胸膜转移、肺及纵隔淋巴结转移、肺及脑转移和肺及骨转移组。　　结果:　　1.肿瘤复发或转移与临床病理指标的联系:203例非小细胞肺癌患者术后随访两年。2年中复发患者63例，复发率为31.0％。术后180天血清CCL20水平在复发组较非复发组及健康人组明显升高(P=0.001)。非复发组较复发组患者辅助性化疗率低(P=0.035)。复发组和非复发组患者在年龄、性别、总出血量、手术时间以及组织学类型无明显差别(P＞0.05)。　　2.辅助性化疗对血清CCL20水平的影响:在部分非小细胞患者术后30天进行了辅助性化疗。为了评价辅助性化疗对血清CCL20水平的影响，我们将辅助性化疗作为主要影响因素，比较了复发组和非复发组患者术后90天及180天血清CCL20水平。复发组和非复发组患者术后90天及180天血清CCL20水平均无明显差别(P＞0.05)。　　3.不同血清CCL20水平患者的复发率:根据术后180天中位数CCL20(57pg/ml)将患者分为高水平组及低水平组。高水平组复发率为41.67％，明显高于低水平组的23.53％(P=0.006)。　　4.无复发生存率分析:术后180天血清CCL20高水平组及低水平组无复发生存曲线。高水平组和低水平组2年无复发率分别为58.3％和76.5％。两组之间总体无复发生存率存在明显差异。血清CCL20高水平组总体无复发时间较低水平组明显缩短(P=0.004)。　　5.多元Cox回归分析:Cox回归模型进一步分析CCL20水平、年龄、性别、出血量、手术时间、组织学类型以及辅助性化疗与早期复发或转移是否独立相关。分析结果表明只有术后180天的血清CCL20水平是与肿瘤早期复发或转移明显相关的预测指标，其风险比为1.061(95％ CI:1.044～1.078)，P=0.001。其他指标均不与术后复发或转移的独立相关。　　6.不同复发或转移部位血清CCL20水平:在2年的随访中发现，最早复发和平均复发时间分别是术后7个月和17.5个月。203例患者中，肺转移者10名、淋巴结转移者11名、脑转移者7名、骨转移者7名、肝转移者6名、胸膜转移者2名、肺及纵隔淋巴结转移者7名、肺及脑转移者6名、肺及骨转移者6名。我们分析了不同复发或转移部位患者术后180天血清CCL20水平。在肝转移和骨转移患者中，其术后血清CCL20水平明显高于其他部位转移者(P＜0.05)。由于胸膜转移患者样本数少，本研究分析时排除。　　结论:　　1.非小细胞肺癌患者术后180天，血清CCL20水平在复发组较非复发组及健康人组明显升高。非复发组较复发组患者辅助性化疗率低。　　2.术后30天给予辅助性化疗的，患者术后90天、180天血清CCL20水平无明显差别。CCL20独立于辅助性化疗。　　3.非小细胞肺癌患者术后180天的血清CCL20水平是与肿瘤早期复发或转移明显相关的预测指标。　　4.合并肝转移和骨转移的非小细胞肺癌患者术后180天血清CCL20水平明显升高。　　第二部分、趋化因子CCL20及其受体CCR6在肺腺癌组织中的表达和定位及与早期复发和转移的相关性研究　　目的:通过观察复发和非复发肺腺癌患者癌组织中CCL20和CCR6的表达和定位，探讨CCL20和CCR6在肺腺癌发生发展中的作用。　　方法:患者选取同第一部分。其中选取病理证实为肺腺癌的患者162例。根据随访2年期间的复发转移情况分为复发组(reconrence group，R(+))和非复发组(non-reconrence group，R(-))。其中复发组50人，非复发组112人。免疫组织化学染色检测CCL20和CCR6的表达和定位;CCL20及CCR6 mRNA的表达采用实时荧光定量PCR分析技术，并应用Western-blot法分析CCL20及CCR6的蛋白表达。　　结果:　　1.非复发组和复发组肺腺癌组织CCL20和CCR6表达的比较:免疫组织化学结果显示CCL20在肺腺癌组织主要表达于细胞膜和细胞浆，CCR6在肺腺癌组织主要表达于细胞浆。在肺腺癌癌旁组织中无明显表达。复发组CCL20表达比例为76％，非复发组为8％，复发组CCL20高表达明显多于非复发组（P=0.000）;复发组CCR6高表达比例为66％，非复发组为6％，复发组CCR6高表达明显多于非复发组(P=0.000);复发组CCL20染色指数为150.42，非复发组为62.48;复发组CCR6染色指数为134.4，非复发组为57.96。两组比较，复发组CCL20和CCR6的染色指数明显高于非复发组。　　2.非复发组和复发组肺腺癌组织CCL20和CCR6 mRNA表达的比较:RT-PCR结果显示，与非复发组比较，复发组肺腺癌组织内CCL20mRNA表达增加了82％（P=0.000），CCR6 mRNA表达增加了56％(P=0.000)。　　3.非复发组和复发组肺腺癌组织CCL20和CCR6蛋白表达的比较:Western-blot结果显示与非复发组比较，复发组肺腺癌组织内CCL20蛋白表达增加了292％（P=0.000），CCR6蛋白表达增加了188％(P=0.000)。　　结论:　　1.CCL20在肺腺癌组织主要表达于细胞膜和细胞浆，CCR6在肺腺癌组织主要表达于细胞浆。在肺腺癌癌旁组织中无明显表达。复发组的表达比例和染色指数较非复发组明显增加。　　2.复发组肺腺癌组织内CCL20、CCR6 mRNA和蛋白的表达明显增加。提示CCL20、CCR6与肺腺癌的发生发展相关。　　第三部分、抑制ERK信号通路对趋化因子CCL20刺激肺腺癌A549细胞系克隆形成的影响　　目的:通过应用CCL20刺激肺腺癌A549细胞系以及应用ERK抑制剂，观察ERK的磷酸化情况和对肺腺癌细胞系A549克隆形成的影响，探讨CCL20和CCR6促进癌细胞的复发和转移的机制。　　方法:肺腺癌A549细胞系的培养。分别加入终浓度为0 ng/ml、10ng/ml、50 ng/ml和250 ng/ml的CCL20刺激肺腺癌A549细胞，培养14天，观察细胞克隆的形成能力。采用Western-blot法分析CCL20(500ng/ml)刺激后0、5、15、30、60 min，ERK及pERK的蛋白表达。克隆形成实验分析应用ERK抑制剂后，不同浓度CCL20刺激A549细胞系的克隆形成能力。　　结果:　　1.CCL20刺激A549细胞后ERK及pERK蛋白表达的变化:CCL20刺激 A549细胞5、15min后均能诱导ERK磷酸化，磷酸化程度在5及15 min增高(P＜0.01)，以15分钟时最高(P＜0.01)。但是其总的ERK水平无变化。　　2.CCL20刺激A549腺癌细胞系克隆形成的变化:计数结果表明，CCL20刺激肿瘤细胞增殖呈剂量依赖性，随着剂量的增加，克隆集落形成增加，50 ng/ml，250 ng/ml组与空白对照和10 ng/ml组比较，明显高于后者（P＜0.01）。　　3.应用ERK抑制剂后，CCL20刺激A549腺癌细胞系克隆形成的变化:在未应用CCL20刺激的A549腺癌细胞系中，应用ERK抑制剂后，克隆形成无明显变化，即组织ERK的磷酸化并不影响基础的克隆形成能力。然而，应用ERK抑制剂可以显著减少CCL20诱导的克隆形成(P＜0.01)。　　结论:　　1.CCL20刺激A549细胞后能诱导ERK磷酸化，磷酸化程度在5及15 min最高，但其总的ERK水平无变化。　　2.CCL20刺激A549腺癌细胞增殖呈剂量依赖型，随着剂量的增加，克隆集落形成增加。　　3.应用ERK抑制剂可以显著减少CCL20诱导的克隆形成。