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以“饮片入药、生熟异治、辅料炮制”为特色的传统中药炮制理论是中医临床用药的重要内容,其中盐制法历史悠久、应用广泛。知母是“盐制入肾”的代表性中药,其盐炙后增强滋阴降火之功为历代医家所认可,但盐炙增效机制缺乏现代科学理论支撑。目前关于知母的研究主要集中于历史沿革、盐炙后单一成分变化、药理效应等方面,关于知母盐炙后效应成分物质基础、体内动态分布研究报道较少。上述问题导致难以制定客观全面的知母质量标准,影响其临床合理、安全用药。课题以生、盐知母为研究对象,以知母代表性的黄酮、皂苷类成分为检测指标。对知母盐炙后物质基础、大鼠血浆药代动力学及不同组织分布进行研究,初步探讨知母盐炙引药下行、增强滋阴降火作用机制。课题研究内容如下:1、文献研究 通过查阅古今文献,从知母炮制历史沿革、现代炮制工艺、炮制机制、化学成分、药理作用及药代动力学过程等方面对知母进行系统的整理,同时对LC-MS的应用作以相关综述,以完善理论基础,为课题制定切实可行的方案。2、考察不同产地生、盐知母中芒果苷、知母皂苷BⅡ等8种成分含量 收集不同产地样品,利用LC-MS技术,以乙腈-0.1%甲酸水为流动相梯度洗脱,测定生、盐知母中芒果苷、知母皂苷BⅡ等8种效应成分含量。结果表明8种成分在规定的浓度范围内线性关系良好、精密度、稳定性、准确度均符合含量测定的要求。不同产地、批次样品中新芒果苷、知母皂苷E1、知母皂苷BⅢ和知母皂苷AⅢ含量差异较大。知母皂苷AⅡ有一批次未检测出,其余批次含量较为稳定。芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷Ⅰ含量较稳定,知母皂苷BⅡ在所测成分中整体含量最高。盐炙后新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅡ、知母皂苷AⅢ含量变化不明显,知母皂苷E1、知母皂苷BⅡ、知母皂苷Ⅰ下降,知母皂苷BⅢ上升。采用SIMCA-P+软件分析生、盐知母的数据。结果表明生、盐知母样品在化学成分含量上具有一定的差异性。对区别生、盐知母贡献值大小依次为知母皂苷E1、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅡ、知母皂苷AⅢ,其中知母皂苷E1、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ对区别生、盐知母样品贡献大,新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅡ和知母皂苷AⅢ贡献较小。3、考察生、盐知母中芒果苷、知母皂苷BⅡ等5种成分大鼠血浆药代动力学 以SD大鼠为实验对象,灌胃生、盐知母提取液后眼底静脉丛取血,蛋白沉淀法处理血浆样品,测定芒果苷、知母皂苷BⅡ等5种成分的血药浓度,探讨5种成分药动学特征。方法学结果符合药代动力学研究技术指导原则。SD大鼠灌胃给予2g/kg生、盐知母提取液后,盐知母组与生知母组相比,新芒果苷、芒果苷知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ吸收速率加快(P<0.01),盐炙后可以加快新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ的吸收速率而对知母皂苷AⅢ的吸收速率无显著性影响;盐炙对黄酮和皂苷类成分在体内停留和作用时间无显著影响;相较于生知母组而言盐知母组中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ的AUC0-T与Cmax变小(P<0.01)。盐炙可影响知母有效成分在大鼠体内的药动学行为。4、考察生、盐知母中芒果苷、知母皂苷BⅡ等5种成分大鼠组织分布 建立SD大鼠组织样品知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ5种成分LC-MS检测方法。大鼠灌胃生、盐知母提取液后,根据药动学实验结果选择时间点采集样品,研究组织样品中知母效应成分分布变化。结果表明,新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ进入各组织的速度较快,在给药后4 h内即达到较高的浓度,甚至在部分组织中为最高浓度点。知母皂苷AⅢ在组织中代谢较慢,甚至在部分组织中24 h达到峰值。5种成分在大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、子宫、前列腺、睾丸组织中均有分布,主要分布在大鼠子宫、肝和肺组织中,其次为肾、心和睾丸,在脾中的分布浓度最低。说明肺、子宫是芒果苷等5种效应成分的主要分布组织。生、盐知母提取液灌胃给予大鼠后,新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ在大鼠组织中的分布存在明显差异,可以明显看出知母盐炙后5种成分在大鼠主要组织中质量浓度均大于生知母灌胃给药后的浓度,说明盐炙可以不同程度的改善知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ在大鼠不同组织中的分布、吸收。盐炙后可以增高新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ在大鼠子宫、睾丸及肾脏中的浓度分布,结合中医传统理论“肾主生殖”的思想,为知母“盐制入肾”提供一定的思路。综上所述,针对知母盐炙入肾的作用机制,课题选择生、盐知母为研究对象,比较知母盐炙前后主要化学成分的物质基础、大鼠血浆药代动力学及组织分布变化情况。实验结果证明,盐炙过程可促使知母中化学成分发生转化,同时可影响药物在大鼠体内的吸收、分布及代谢过程。课题创新性的将LC-MS融入知母“盐制入肾”这一传统炮制理论研究领域中,研究结果为进一步阐释知母盐炙后增强滋阴降火作用的可能机制奠定了基础。