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背景：Hca-F细胞和Hca-P细胞是本课题组多年以前通过有限稀释法从同一小鼠肿瘤细胞中筛选分离出的两个不同淋巴道转移能力亚克隆，经局部皮下接种，均特异性地向引流淋巴结转移。Hca-F为高淋巴道转移能力细胞，淋巴结转移率＞70%；Hca-P为低淋巴道转移能力细胞，淋巴结转移率＜30%。由于二者来源于同一亲本细胞系，具有基本相同的遗传背景，两者的差异主要集中在转移表型上，因此在肿瘤淋巴道转移机制研究中可互为参照的细胞系模型。在前期研究中，我们利用基因芯片技术、比较蛋白质组学技术等，筛选出若干在Hca-F细胞和Hca-P细胞中差异表达的基因和蛋白质，其中就有Annexin A7。Hca-F中Annexin A7mRNA的表达是在Hca-P中的3.48倍，Hca-F中Annexin A7蛋白的表达是在Hca-P中的3.0倍。我们进一步建立了pcDNA3.1-Annexin A7稳转的Hca-P细胞和pSilencer-shRNA-Annexin A7稳转的Hca-F细胞。荧光定量PCR和Western blot检验结果表明，Annexin A7在前者表达显著上调，在后者显著下调。Annexin A7表达下调的Hca-F细胞细胞迁徙能力降低，Annexin A7表达上调的Hca-P细胞迁徙能力增强。目的:表型是细胞在整体水平上对胞内、外信号产生的生物学效应。表型变化背后的一系列分子生物学事件，特别是生物大分子之间的相互作用，是人们理解各种生物学过程，认识疾病机制的基础。本研究旨在寻找小鼠肝癌细胞中AnnexinA7相互作用蛋白，为相关信号通路的研究提供线索。材料与方法:用含10%小牛血清RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2孵箱培养小鼠肝癌细胞系Hca-F细胞。离心收集小鼠肝癌Hca-F细胞，冰上裂解。包被ProtG的磁珠与Annexin A7抗体、无关抗体以及正常小鼠血清孵育以固定抗体。洗涤后，与Hca-F细胞裂解物孵育。洗去杂蛋白，用加入了还原剂的1X LDS samplebuffer将磁珠上的蛋白复合体洗脱下来。免疫沉淀产物经SDS-PAGE电泳分离和Coomassie blue染色。将差异蛋白条带挖出并切成边长1mm-2mm的小方块。用25mM NH4HCO3/50%CH3CN组成的脱色液洗3次，每次浸泡15分钟，用60℃的TCEP还原10分钟，常温Iodoacetamide在暗处脘基化1hour。100%CH3CN缩胶,空气干燥后与活化的胰酶37℃孵育4小时。取10ul水解后的多肽溶液上样至液相色谱（HPLC）分离。使用MASCOT软件对orbitrap MS获得的质谱文件搜库，使用的数据库为IPI mouse database3.86。Western Blotting使用抗体如下：兔源抗Annexin A7、兔源抗Integrinβ1、鼠源抗Plectin、鼠源抗RACK1、鼠源抗Integrinα3、羊抗兔IRDye800CW和羊抗鼠IRDye800CW，使用Li-COR Odyssey infraredimager在800nm激发波长通道检测荧光信号。细胞均匀涂在载玻片上，4%多聚甲醛固定10min分钟，封闭后与下列一抗4°C孵育过夜：anti-RACK1（鼠）、、anti-Plectin（鼠）、 Anti-Integrinα3（鼠）、anti-Annexin A7（兔）、anti-Integrinβ1（兔）和anti-Annexin A7（鼠）。分别用PGEX-2T-Anxa7和PGEX-2T转化感受态细胞E.coli BL21,体外表达GST-AnnexinA7融合蛋白和GST。SDS-PAGE电泳及用anti-GST进行Western blot检验蛋白表达效果。结果:选择3条特异性猎物蛋白条带，应用鸟枪法LC-MS/MS鉴定差异条带胶内酶切所得多肽样品，质谱文件搜库结果见附录。我们用WB方法验证了来自条带A的Plectin；来自条带C的Integrinα3和来自条带E的Integrinβ1，证实Plectin、Integrinα3和Integrinβ1与Annexin A7共沉淀。此外，我们用Rack1抗体WB方法在Annexin A7IP产物中检测Rack1，结果证实IP产物中存在Rack1。HCa-F细胞的双色免疫荧光染色显示Annexin A7和RACK1在细胞内的共定位（黄色融合信号）多见于靠近胞膜的细胞周边区域。Annexin A7与Plectin在肝癌细胞中的共定位主要在胞质。未见明确的Annexin A7与Integrinβ1或者Integrinα3共定位。以上结果显示Plectin和RACK1这两个接头蛋白在小鼠肝癌细胞中与Annexin A7形成蛋白复合体。为了进一步验证Annexin A7与Rack1或Plectin是否直接结合，我们用GST-Annexin A7融合蛋白表达质粒和空载体质粒转化大肠杆菌，体外原核表达了GST-Annexin A7和GST,为后期pull-down assay提供带GST标签的诱饵蛋白和阴性对照。结论：首次报道Plectin和RACK1与Annexin A7形成蛋白复合物。利用大肠杆菌诱导表达了GST-Annexin A7融合蛋白，为下一步验证Annexin A7和RACK1或Plectin体外直接结合提供诱饵蛋白。