烟草坏死病毒A中国株系(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate, TNV-AC)是在我国大豆上发现的TNV-A的一个新株系,属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)坏死病毒属(Necrovirus),可侵染多种重要经济作物并造成严重危害。本实验室前期研究表明,TNV-AC的外壳蛋白(Coat protein, CP)定位于受侵染细胞的细胞核。理论上此类ss(+) RNA病毒的复制主要在寄主细胞质中完成,不需要核过程,因此推测其CP定位于细胞核可能有重要的生物学功能。通过在TNV-AC侵染性cDNA克隆上构建一系列缺失突变和点突变并接种本生烟,用Western blot分别检测感病叶片细胞核和细胞质组分,确定CP核定位关键区域为16RTPEQQVIEDQRDARRLARGR36,其中的精氨酸对CP的核定位具有关键作用。在本生烟中瞬时表达野生型及其突变体的CP-GFP融合蛋白以及双分子荧光互补(BiFC)实验,结果也表明aa16-36为CP核定位的关键区域,且通过经典的importin α/β途径进入细胞核。aa122-139为富含亮氨酸的区域,可能是核输出信号,将其中的亮氨酸突变为丙氨酸后,CP只在细胞核中富集。通过Leptomycin B出核运动抑制实验,证明aa122-139是受CRM1/Exportin1调控的出核信号。此外,我们还发现aa75-80与CP出核运动相关,它的缺失和突变会影响CP的出核运动。CP是TNV-AC在本生烟中系统运动的决定因子,将CP只定位于细胞质的突变体(M16和M16RA)和只定位于细胞核的突变体(M13、M23、M7和M24)分别接种本生烟,在接种叶虽然可以发病,但不能建立系统侵染。为保持CP的完整功能,进一步分别在CP终止密码了前插入外源的核定位信号和出核信号序列,构建了重组病毒TNV-ACP:NLS和TNV-ACP:NES,接种本生烟后发现TNV-ACP:NLS丧失系统侵染能力,而TNV-ACP:NES不仅能够系统侵染,并且其在上部未接种叶片病毒RNA积累水平高于野生型,系统叶的发病症状更为严重。这些实验结果表明,CP不能输出细胞核的突变体(M13、M23、M7、M24和TNV-ACP:NLS)会导致病毒RNA不能包装,进而丧失系统运动的能力；CP只定位于细胞质、不进入细胞核的突变体(M16和M16RA)可能丧失了与病毒RNA结合的能力也不能系统侵染本生烟；只有CP具有进核和出核过程并在细胞质中稳定存在(TNV-AC和TNV-ACP:NES),病毒才能系统侵染。因此,CP的核质穿梭在TNV-AC系统侵染本生烟的过程中起关键作用。采用瞬时表达GFP融合蛋白的方法,还对TNV-AC编码的运动蛋白P8和P6以及复制酶小亚基P23进行了业细胞定位。其中,GFP-P8融合蛋白定位在本生烟和洋葱表皮的细胞核中,其N端15RGRARSSEGKK25的碱性氨基酸(R和K)是核定位的关键氨基酸。P6-GFP融合蛋白在本生烟细胞、洋葱表皮细胞和普通烟BY-2悬浮细胞中主要分布在内质网,细胞核外周膜和细胞膜。在BiFC的系统中CP与P8,CP与P6之间不存在互作。GFP-P23融合蛋白在本生烟叶片中主要定位在细胞膜和囊泡的膜结构上,并形成一些聚集体。通过丛因芯片、转录组测序和病毒诱导的丛因沉默CVIGS)等高通量的研究方法筛选与病毒互作的寄主基因,都需要精确测定寄主基因转录水平的丰度,实时荧光定量PCR (qPCR)是检测目标基因在转录水平的表达量的最常用的技术。为了得到目标基因真实的表达量,首先要为qPCR实验选择合适的内参基因。然而,关于单子叶植物受到病毒侵染后,其内参基因稳定性的信息很少。因此我们分别将大麦条纹花叶病毒(BSMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV)和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)侵染相应的单子叶植物(包括二穗短柄草、大麦、高粱、小麦和玉米),进而利用qPCR测定10种候选内参基因(ACT, EF1α, FBOX, GAPDH, GTPB, PP2A, SAND, TUBβ, UBC18和UK)在病毒侵染与非侵染的单子叶植物中的Ct值,通过3种常用的算法(geNorm、NormFinder和BestKeeper)对获得的Ct值进行分析,得出针对不同病毒侵染条件下5种单子叶植物中10种内参基因的稳定性排序。结果表明,不同的单子叶植物/病毒组合条件下,最稳定的内参基因有时表现为一致,有时则不同,再次强调了进行qPCR定量实验前选择合适内参基因的重要性。同时,选择PR-1基因作为检测的靶标,确定了本文所得最稳定内参基因用于qPCR定量的有效性。以上结果为利用qPCR技术分析病毒与单子叶植物互作过程中寄主基因的表达提供了可靠的内参基因选择依据。