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目的本课题主要研究LPS对RAW264.7细胞表达破骨相关炎症因子IL-1α(interleukin-1α,白细胞介素-1α)、IL-1β(interleukin-1β,白细胞介素-1β)、IL-6(interleukin-6,白细胞介素-6)、IL-10(interleukin-10,白细胞介素-10)、MCSF(macrophage colony stimulating factor,巨噬细胞集落刺激因子)和TNF-α(tumor necrosis factor-α,肿瘤坏死因子-α)的影响,并探讨相关作用机制。方法(1)体外培养RAW264.7细胞,用100 ng/ml P.g-LPS诱导24 h,荧光倒置显微镜下观察,TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase,抗酒石酸酸性磷酸酶染色)染色。(2)将RAW264.7细胞接种于激光共聚焦皿贴壁12 h,4%多聚甲醛固定、封闭,用生理盐水代替一抗作为阴性对照,孵育小鼠Ca SR单克隆抗体,4℃过夜,室温下避光孵育荧光二抗45 min,DAPI复染,激光共聚焦显微镜观察记录;用不同方法提取细胞膜蛋白,Western blot验证细胞膜上Ca SR的表达。(3)用CCK-8法检测不同浓度(0、3、6、12、24μM)的NPS2143在不同孵育时间(0、6、12、24 h)对RAW264.7细胞存活率的情况,根据CCK-8实验结果,在尽量不影响细胞存活率情况下,选择最佳的抑制剂浓度;将实验设为4组:a)对照组:用完全培养基培养;b)LPS组:用含100 ng/ml LPS的完全培养基培养;c)NPS2143组:用含3μM NPS2143的完全培养基培养;d)LPS+NPS2143组:用含100 ng/ml LPS+3μM NPS2143的完全培养基培养。其中c)组和d)组,在实验前用含NPS2143的完全培养基预培养6 h,a)和b)组用不含NPS2143的等体积DMSO代替,同时预处理6 h。q RT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,荧光定量PCR)检测a),b),c),d)4组的IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和MCSF在m RNA水平的表达,Luminex 200液相蛋白芯片检测系统检测IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和MCS蛋白水平的表达。结果(1)100 ng/ml P.g LPS诱导RAW264.7细胞24 h即可见镜下开始出现多核巨细胞,形态不规则,有伪足,胞浆TRAP活性部位染色呈红色。(2)免疫荧光和Western blot检测示RAW264.7细胞膜上存在Ca SR表达。(3)CCK-8结果显示,最佳的抑制浓度为3μM。q RT-PCR检测结果显示,100 ng/ml P.g-LPS处理后,与a)组相比,b)组中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、MCSF和TNF-α的表达均有不同程度的提高;c)组与d)组相比,NPS2143拮抗Ca SR后IL-1α、IL-6、MCSF和TNF-α基因表达变化明显升高(P<0.05),而IL-1β和IL-10明显降低(P<0.05);液相芯片检测结果示,只有IL-6、IL-10、TNF-α蛋白水平表达较高,且表达变化与m RNA的表达变化基本一致,IL-1α、IL-6、MCSF和TNF-α上调,IL-1β、IL-10下调(P<0.05)。结论P.g LPS能诱导RAW264.7细胞形成TRAP(+)破骨细胞样细胞;上调IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和MCSF的基因表达,但由于IL-1α、IL-1β、MCSF表达量低,只检测到IL-6、IL-10、TNF-α的蛋白表达升高;RAW264.7细胞表面表达Ca SR,当Ca SR被NPS2143拮抗,IL-6、TNF-α表达量升高,IL-10的表达降低,说明Ca SR参与LPS诱导的细胞炎症因子表达调控。