甲烷蛋白的制备及核酸去除

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甲烷氧化菌是可以利用甲烷作为唯一碳源进行生长的革兰氏阴性细菌,是生产甲烷单细胞蛋白的主要菌体。甲烷作为制备甲烷单细胞蛋白(甲烷蛋白)的碳源,是碳的完全还原形式,没有产生直接毒性的问题,不含致癌的稠环芳烃等杂质,在发酵工艺过程中也不需要昂贵的提纯设备,国内对甲烷蛋白的研究仍处在试验阶段。本论文主要研究了几种生长因素对甲基弯菌Methylosinus trichosporium IMV3011生长的影响以及过量核酸的去除并确立一种简单有效的核酸去除方法。为利用甲烷氧化菌生产甲烷单细胞蛋白奠定基础。本实验的研究内容包括:根据甲烷氧化菌利用碳源的特殊性对甲基弯菌IMV3011在间歇发酵中进行开放式培养,并与封闭式环境下培养的IMV3011在菌体生长曲线以及MMO酶活性方面进行比较,验证了其在非灭菌的情况下也能正常生长。采用每日更换新鲜培养基的方法对IMV3011进行半连续培养,分析菌体生长哪个阶段更适于补加新鲜培养基,确定一种较优的培养方式。验证得出培养IMV3011时可以在48h后进行新鲜培养基的补料和添加,这样有助于一些对其生长起正向作用的代谢产物的积累,有利于工业化生产。不同外源因子对甲烷氧化菌生长的影响。分别考察了D-生物素、叶酸、核黄素、维生素B12等生长因子对IMV3011生长的影响,并对不同生长因子的添加对菌体生长的影响进行了比较。结果表明:未添加外源因子时,菌体生长延滞期为62.5h,发酵终止后干重为0.31gdwcL-1。D-生物素添加量为1Oug/L时,延滞期缩短到5.8h,发酵终止后的干重为0.29gdwcL-1,与未添加时相比大大缩短了延滞期的时间但干重有所下降。叶酸添加量为5ug/L时,延滞期最短,缩短到3.2h,发酵终止后的干重为0.97gdwcL-1是未添加时的3倍。核黄素添加量为5ug/L时,延滞期缩短到15.1h,发酵终止后的干重为0.77gdwcL-1,是未添加时的2.5倍。维生素B12添加量为0.5ug/L时,延滞期为18.7h,发酵终止后的干重为0.84gdwcL-1,是未添加时的2.7倍。研究了超声波法、浓盐法、浓盐与超声波破碎结合法、菌体自溶法等四种处理方法对菌体中核酸的脱除效果。通过比较得出菌体自溶法是去核酸的最优方法。研究了温度、菌体浓度、处理时间、体系pH值等四种因素对菌体自溶法脱除核酸效果的影响。通过菌体自溶法的单因素实验和正交实验,确定了最优实验方案,得出IMV3011中过量核酸的脱除的最佳条件为:温度70℃,菌体浓度0.9%(湿重),处理时间50min,体系pH值10。在此最佳条件下核酸脱除量最大值为44.75ug/mL,以菌体内核酸含量占菌体干重的9.9%计算,脱除率为50.2%。
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