家蚕BmCRP基因的原核表达和功能初步研究

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从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条cDNA序列,该序列为首次报道,GenBank登录号为DN985186.1,由4个外显子和3个内含子构成。该序列长度为101.bp,ORF长67.bp,编码224个氨基酸残基,编码的蛋白的N-端富含半胱氨酸,所以把它命名为BmCRP(Bomby.mor.cys-ric.protein),生物信息学预测其分子量24.9.kD,预测等电点为5.12。将BmCRP与数据库中的蛋白进行比对,发现该蛋白仅与昆虫果蝇中的一些假想蛋白具有一些同源性(最高的同源性为31%),而在其他种属中同源性较低。   通过PCR扩增BmCRP的ORF,纯化产物经BamHI和Xh.I双酶切后插入到pET-28a(+)的Bam.I和Xh.I位点,筛选获得重组表达质粒pET-28a(+)-BmCRP,经PCR、双酶切鉴定以及测序分析证实重组正确,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌BL21(DE3)。工程菌经.mM的IPTG诱导后,收集菌体并裂解,作SDS-PAGE分析,结果在2.kD处有一浓集目的蛋白条带,与预期值相符。融合蛋白以不溶性的包涵体的形式存在,超声波裂解菌体分离包涵体并离心、洗涤;对包涵体进行溶解和梯度透析复性;采用亲和层析纯化融合蛋白rBmCRP。以该融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备了rBmCRP多克隆抗体,ELISA检测该抗体的效价可达到1:6400。免疫印迹检测显示该抗体对rBmCRP具有较好的特异性。免疫印迹检测结果还表明,BmCRP在家蚕五龄幼虫的头部、表皮、马氏管、卵巢和睾丸中有表达,在家蚕的卵、幼虫、蛹、蛾等时期均有表达。荧光定量PCR结果显示BmCR.mRNA在家蚕五龄幼虫各组织中均有表达,在表皮中量最高,脂肪体中的量最低;从卵到蛾,该基因的表达水平呈增加趋势。细胞定位实验结果显示BmCRP蛋白在Bm5细胞的细胞核和细胞质中均有表达,细胞核中的荧光信号比细胞质中的要强。本研究结果为进一步研究家蚕BmCRP蛋白的结构和功能奠定基础。
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