东方山羊豆(Galega. orientalis L.)为豆科山羊豆属植物,是一种优质的饲用牧草。东方山羊豆产草量高,利用年限长,抗逆、抗病性强,适口性好,具有促进奶牛产奶量和乳脂率的提高等功能,适宜建植人工草地与改良天然草地,在我国“退耕还草、退牧还草、草田轮作”中应用前景将十分广阔,对东方山羊豆这些特性的深入研究和开发利用具有非常重要的经济与生态意义。为了探讨东方山羊豆应答环境胁迫的分子机制,本论文开展了抗逆转录因子相关基因的分离、克隆以及表达特性分析,并通过转基因技术获得转基因植株,为探讨和改良牧草对非生物胁迫的耐性提供了理论依据和技术保障。目前,取得如下的研究进展:一、分离了1个冷诱导的东方山羊豆ERF转录因子基因GoDREB全长序列,初步明确了其特性及功能。1.采用RACE的克隆方法,从东方山羊豆中克隆到一个ERF类转录因子,将其命名为GoDREB。基因序列ORF区为1095bp,编码一个由364个氨基酸组成的蛋白。序列分析表明: GoDREB基因中具有一个内含子,长度为1332 bp,在ORF的第255个核苷酸(T)与第256个核苷酸(A)之间; GoDREB基因具有ERF转录因子所特有的核定位信号、DNA结合域以及转录激活域;它与其他已知的ERF基因除了在保守的AP2/EREBP结构域处具有很高的同源性外,在其它的区域同源性也较高。GoDREB具有植物ERF转录因子典型的结构特征,是植物ERF转录因子家族的一个新成员,属于该转录因子家族的classIV亚族。2.采用实时荧光定量PCR的方法,对东方山羊豆逆境胁迫下的表达特性进行分析。实验结果表明GoDREB在东方山羊豆中的转录表达不仅受低温、PEG和盐诱导,而且也受外源激素MeJA和SA的诱导;其中,受低温诱导的变化明显早于PEG和盐诱导,而对ABA的诱导几乎没有响应,由此推测GoDREB可能主要通过SA/JA途径参与对逆境的早期防卫反应,而不依赖于ABA途径。运用半定量RT-PCR方法,分析了GoDREB基因在东方山羊豆不同组织中的表达特异性,结果表明:东方山羊豆GoDREB基因在三种组织中的表达存在差异,相比而言在叶中的表达最强,在茎中的表达较弱,而在根中的表达量为最弱。GoDREB基因在各个器官都具有一定的表达量说明它本身是一个组成型表达的基因。3.通过分子分析证明GoDREB是定位在细胞核。亚细胞定位结果表明,pCAMBIA1302-GoDREB-GFP融合蛋白集中分布在细胞核中,而对照pCAMBIA1302在细胞核和细胞质中均有分布,证明了GoDREB具有核定位的特性。4.获得了转GoDREB基因烟草植株。通过农杆菌介导法将GoDREB转入烟草中,对转基因烟草T0代植株进行PCR检测和RT-PCR鉴定。结果表明,GoDREB基因已经整合到烟草基因组中,并可在转录水平正常表达。二、分离到1个冷诱导的东方山羊豆RAV转录因子基因GoRAV全长序列,初步明确了其特性及功能。1.通过RT-PCR和RACE方法,分离到1个冷诱导的东方山羊豆RAV转录因子编码基因GoRAV, ORF区为1164bp,编码由387个氨基酸残基组成的RAV转录因子GoRAV。通过分析GoRAV基因的结构,证明在该基因内部没有内含子。序列比对分析表明,GoRAV是RAV转录因子家族的一个新成员。GoRAV与豆科植物大豆GmRAV的一致性最高,与双子叶植物的RAV具有相对较高的同源性,而与单子叶植物的序列一致性略低。2.通过实时荧光定量PCR分析了GoRAV在逆境胁迫下的表达特性。实验结果表明GoRAV基因在东方山羊豆中能够被PEG和低温、以及外源植物激素ABA、SA和MeJA诱导,初步推测GoRAV可能通过ABA/MeJA信号传导途径参与东方山羊豆对逆境的防御反应。半定量RT-PCR方法分析GoRAV基因在东方山羊豆不同组织中的表达特异性,结果表明:GoRAV基因在三种组织中的表达存在差异,在根中不表达,在茎和叶中均有较强的表达。3.通过分子分析证明GoRAV是定位在细胞核。亚细胞定位结果表明,pCAMBIA1302-GoRAV-GFP融合蛋白集中分布在细胞核中,而对照pCAMBIA1302在细胞核和细胞质中均有分布,证明了GoRAV具有核定位的特性。4.获得了转GoRAV基因烟草植株。通过农杆菌介导法将GoRAV转入烟草中,对转基因烟草T0代植株进行PCR检测和RT-PCR鉴定。结果表明,GoRAV基因已整合到烟草基因组中,并在转录水平正常表达。