质粒介导的喹诺酮耐药(PMQR)是近年来发现的一种介导低水平喹诺酮类药物耐药的重要机制,自发现以来一直是国内外关注的热点。PMQR基因在人源和畜禽源肠杆菌中检出率呈现逐年上升趋势,尤其是同时介导氨基糖苷类和氟喹诺酮类药物(FQs)耐药的aac(6’)-Ib-cr基因在大肠杆菌和沙门菌的检出率在不断升高。然而,关于aac(6’)-Ib-cr基因在临床广泛流行的原因尚未见研究,该基因和其他的喹诺酮耐药机制如靶位基因突变及外排泵等之间的相互关系在国内外也尚未见报道,同时该基因的广泛流行对菌株耐药发展是否存在影响也不清楚。因此,本研究以畜禽源沙门菌为研究对象,分析了沙门菌中PMQR基因尤其是aac(6’)-Ib-cr基因的流行情况,靶位基因突变情况及它们与环丙沙星敏感性的关系,阐明了aac(6’)-Ib-cr和oqx AB基因与ESBLs基因的协同传播机制,着重研究了aac(6’)-Ib-cr基因对喹诺酮耐药发展以及对流行的耐药质粒捕获的影响,从而进一步阐述了PMQR尤其是aac(6’)-Ib-cr介导的氟喹诺酮类耐药机制,为防控畜禽源沙门菌多重耐药的产生和传播提供理论依据。1.畜禽源沙门菌中PMQR基因的流行及其与环丙沙星耐药性的关系本研究2014年从我国不同省或市的多个规模化猪场和鸡场分离到159株沙门菌,采用玻片凝集法对所有菌株进行血清型鉴定,结果显示159株沙门菌共有3种血清型:鼠伤寒(n=95),印第安纳(n=63)和肠炎(n=1);采用琼脂二倍稀释法测定了菌株对兽医临床常用的6类抗生素的的敏感性,结果显示畜禽源沙门菌的耐药现象比较严重,对四环素,氨苄西林,链霉素和庆大霉素的耐药率都超过了80%,对氟喹诺酮类药物的耐药率超过了60%,对头孢噻肟和动物专用药头孢噻呋的耐药率也在50%左右,且全部为多重耐药。采用PCR及测序的方法检测PMQR基因的流行情况和靶位基因QRDR的突变情况,并分析PMQR,靶位基因突变以及喹诺酮MIC之间的关系。结果表明,90.6%的沙门菌至少携带一种PMQR基因,其中以oqx AB(78%)和aac(6’)-Ib-cr(69%)最为常见并且两者多共存于同一菌株中。85.5%的菌株发生靶位基因的突变,以gyr AD87N单突变和gyr A:S83F D87G+par C:T57S S80R突变组合最为流行,91.8%的aac(6’)-Ib-cr基因阳性菌中检测到靶位基因的突变,其中54.5%的突变是gyr AD87N单突变。aac(6’)-Ib-cr+oqx AB或aac(6’)-Ib-cr+oqx AB+qnr共存的菌株对环丙沙星的耐药率分别为72.1%和95.5%,且多表现为对喹诺酮类药物较高水平耐药(MIC≥16mg/L)。在有aac(6’)-Ib-cr+oqx AB基因存在的菌株中,仅gyr AD87N单突变存在时环丙沙星的MIC≥16mg/L,耐药水平与多突变的菌株差别不大,说明在这种菌株中环丙沙星的耐药水平与突变的个数不呈正相关。因此在畜禽源沙门菌中aac(6’)-Ib-cr基因流行较高,且常与oqx AB基因及gyr AD87N单突变共存于同一菌株中,对环丙沙星的高水平耐药起着重要作用。2.aac(6’)-Ib-cr和/或oqx AB阳性菌株中ESBLs基因的流行及传播机制研究用PCR和测序方法对aac(6’)-Ib-cr和/或oqx AB阳性菌株中ESBLs基因的流行情况进行调查,结果表明在144株aac(6’)-Ib-cr和/或oqx AB阳性菌株有45株检测到ESBLs基因,全部为blaCTX-M-9G基因,检出率为31.3%,共有三种亚型,最为流行的是bla CTX-M-27(n=34),其次为bla CTX-M-65(n=7)和bla CTX-M-14(n=4)。45株bla CTX-M阳性菌株中有35株携带oqx AB基因,31株携带aac(6’)-Ib-cr基因。采用PFGE,接合转移/电击转化和S1-PFGE、Southern杂交对aac(6’)-Ib-cr和/或oqx AB和blaCTX-M基因的协同传播机制进行了研究。PFGE结果显示这些阳性菌株中存在克隆传播,从而促进了aac(6’)-Ib-cr和/或oqx AB-blaCTX-M基因的垂直传播;接合转移/电击转化结果显示45株blaCTX-M阳性菌株中有38株发生转移,且68.4%的阳性菌株发生aac(6’)-Ib-cr和/或oqx AB共转移。对质粒特征分析结果表明质粒大小在80~280kb之间,共检测到5种不同的质粒复制子类型,14株携带blaCTX-M-27接合子/转化子的质粒是不可分型的。结果表明菌株的克隆传播以及耐药质粒(P-like质粒)的水平传播是导致blaCTX-M基因和aac(6’)-Ib-cr和/或oqx AB基因协同传播的重要原因。3.aac(6’)-Ib-cr基因对喹诺酮类药物耐药的影响将aac(6’)-Ib-cr基因克隆到质粒载体上,构建重组质粒,然后导入到J53,DH5α以及实验室构建的鼠伤寒沙门菌标准株SL1344和野生株SH10的外排泵缺失菌中,测定菌株的MIC、MPC及适应性,并用浓度递增法诱导菌株耐药,研究aac(6’)-Ib-cr基因对氟喹诺酮耐药以及耐药发展的影响。结果表明导入携带aac(6’)-Ib-cr基因的重组质粒可以使菌株对环丙沙星的MIC升高2~4倍,MPC增加8~16倍,同时使菌株在共培养时具有竞争优势。在耐药发展过程中,在J53及DH5α导入携带aac(6’)-Ib-cr基因的重组质粒时,并不促进喹诺酮类药物作用靶位的突变,但增加菌株的突变频率;另外,在加入外排泵抑制剂后,环丙沙星的MIC显著降低,可达32~267倍,显著高于无aac(6’)-Ib-cr基因的菌株。而在SL1344和SH10菌株中,敲除Acr AB-Tol C外排泵,不利于菌株的生长和导入重组质粒,在获得aac(6’)-Ib-cr重组质粒的外排泵缺失株的耐药发展过程中,发现aac(6’)-Ib-cr可协同靶位基因以及其他的外排泵提高菌株向高水平耐药发展的能力。因此,aac(6’)-Ib-cr基因不仅降低菌株对喹诺酮类药物的敏感性,提高菌株的防突变浓度,增强菌株的竞争能力,而且在喹诺酮类药物耐药发展过程中增加突变频率,与外排泵机制共同加速高水平耐药菌株的筛选。4.质粒全测序以及aac(6’)-Ib-cr基因对质粒的影响初探为进一步研究aac(6’)-Ib-cr基因存在时,对菌株捕获其他耐药质粒的影响,对上述研究中较为流行的携带blaCTX-M-27基因的不可分型的质粒采用高通量测序对其核酸全序列结构特征进行了分析,结果表明携带blaCTX-M-27的p SC15质粒大小为103.44kb,是一个P-like(类噬菌体)质粒,与噬菌体P7相似度达73%,质粒上含有大量的噬菌体基因。将p SC15导入到有/无aac(6’)-Ib-cr的菌株中,结果表明在aac(6’)-Ib-cr存在时,菌株容易捕获P-like质粒p SC15,aac(6’)-Ib-cr可以补偿p SC15的适应性代偿,使菌株的生长能力提高,竞争能力增强。该基因的存在可能有利于菌株捕获其他的耐药质粒并且提高菌株捕获其他质粒后的竞争能力,这在一定程度上可以解释临床上aac(6’)-Ib-cr基因广泛流行且一般存在与多重耐药菌株中的原因。