心肌组织对缺氧高度敏感，缺血/缺氧性心肌损害是严重创伤的常见并发症，也是以冠状动脉粥样硬化为代表的多种心血管疾病造成心肌损害的共同形式。心肌细胞缺氧不仅是严重创伤后心功能衰竭的重要原因，也是启动和诱发其它脏器损伤形成多脏器功能不全/衰竭的重要始动因素。缺氧的生物学效应与发生机理历来是生命科学中倍受关注的热点研究领域之一，其意义不仅是在于在细胞与分子水平揭示缺氧危害的分子基础，更重要的是这一问题的阐明将在临床医学领域中对常见的缺血/缺氧性心脑疾病的防治与肿瘤的治疗产生重大的影响。研究心肌缺氧损害的分子机理与调控途径对于临床防治严重创伤和多种心血管疾病的危害、寻找有效的拮抗心肌损害的措施具有重要的理论依据与实际意义。近年来研究表明，无论是在低等的模式生物(如线虫、果蝇等)还是在高等的脊椎动物(如大鼠、恒河猴等)，缺氧导致细胞死亡的主要方式是通过诱导细胞凋亡而产生的。细胞凋亡是在生物进化过程中形成的一种调节生命活动过程的重要机制，凋亡的发生是组织器官正常发育与免疫功能的形成所必需的，另一方面，过度的凋亡是机体受到环境有害刺激因素(包括缺氧、电离辐射等)作用产生损伤的主要机制之一。近年来研究表明在哺乳动物细胞凋亡过程中天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶(称为Caspases)家族的激活起关键作用。Caspases在正常细胞中以无活性的前体形式合成与储存，无活性的前体由四个不同的结构域构成：氨基末端区域(prodomain)，一个大亚基、一个小亚基和一个位于大小亚基之间的连接片段。Caspase的激活是通过蛋白水解，除去prodomain和连接片段，将大、小亚基聚集成一个异二聚体。根据Caspases家族各成员的一级结构，在级联反应中的位置及<WP=9>N端序列上的特点不同，可将其分为两类：上游Caspases(起始Caspases,包括Caspase-1,2,4,5,8,9,10,11,12,13)和下游Caspases(效应Caspases,包括Caspase-3,6,7)。起始Caspases具有prodomain，包含死亡效应区(death effector domain，DED)和Caspases募集区(Caspases recruitment domain，CARD)两个结构域。相反，效应Caspases则不具有prodomain。从1993年首次发现Caspase参与细胞凋亡过程到现在，对Caspase的激活与调控机理已经有了基本的认识，但对缺氧诱导心肌细胞Caspases家族的激活以及导致细胞凋亡的相关信号传导机理尚未完全阐明。本课题研究在原代培养的新生大鼠心肌细胞复制缺氧损伤的模型，应用RT-PCR、Western blot、激光共聚焦显微镜分析等现代分子生物学的方法，集中研究了线粒体依赖性Caspase-3激活介导的心肌细胞凋亡与缺氧致心肌细胞损伤的关系，从线粒体Cyt c释放、Caspase-9,-3的表达与激活、染色体DNA损伤、胞浆游离钙的变化等方面深入地探讨缺氧诱导心肌细胞凋亡的分子机理和可能的调控环节，为阐明缺氧性心肌损害的分子基础，尤其是在肯定线粒体依赖性的Caspase-3激活途径在缺氧诱导心肌细胞凋亡过程中的作用等方面，提供新的实验依据。本课题研究的主要结果和结论包括如下几方面：1. 缺氧致心肌细胞损伤的主要方式是诱导细胞凋亡。缺氧3h与对照值相比心肌细胞存活率未见显著改变，缺氧6h开始心肌细胞存活率显著低于对照值(p<0.05)，并呈进行性下降，至24h，细胞存活率下降约42%，非常显著地低于对照值(p<0.01)，细胞凋亡是主要死亡方式，表现为细胞存活率呈进行性下降、凋亡细胞率增高、细胞出现典型的凋亡形态学特征、染色体DNA出现特征性的片段化。2. 缺氧可致心肌细胞线粒体Cyt c大量释放至胞浆，线粒体与胞浆中Cyt c含量呈典型的消长关系。缺氧3h线粒体Cyt c未见显著变化，而胞浆成分中开始增多，至缺氧12h，线粒体中大部分Cyt c已释放至胞浆中，此时线粒体仅见一弱阳性条带，而胞浆达到峰值水平，呈强阳性反应，缺氧24h，用western blot方法在线粒体中已不能检测到Cyt c，而胞浆中维<WP=10>持在峰值水平。3. 缺氧可上调心肌细胞Caspase-3, -9基因表达，两者表达变化趋势一致，在缺氧3h即开始明显增高，在观察的24h内持续处于高表达状态，酶活性定量分析结果表明Caspase-3的激活与其基因表达上调的变化相吻合。4. 缺氧所致心肌细胞钙超载在时序上出现早于线粒体Cyt c释放与Caspase-3的激活。缺氧后30min心肌细胞胞浆游离钙即显著增高，1h胞浆游离钙浓度增高达到峰值水平，缺氧3h仍维持在峰值水平，对单个细胞的平均荧光强度分析表明，缺氧后30min、1h、2h荧光强度与正常对照相比分别增加21、36、38倍，提示心肌细胞胞浆游离钙浓度显著增高，从时序上来看，细胞钙超载是先于细胞存活率下降和出现细胞凋亡的一个早期分子事件，因此细胞钙超载是启动线粒体Cyt c释放与Caspase-3激活的一个早期重要的分子事件，其直接证据是螯合细胞内钙可阻断缺氧诱导的Caspase-3激活，并拮抗心肌细胞凋亡的发生。5. 应用Caspase-3 的特异性抑制剂z-DEVD.fmk 100μmol预处理培养的心肌细胞2h，然后暴露于缺氧，在缺氧后不同时间检测心肌细胞存活率，结果表明抑制缺氧诱导的Caspase-3 激活可拮抗心肌细胞存活率下降，表现为z-DEVD.fmk 100 μmol预处理仅在缺氧24h细