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由于肿瘤切除、牙周疾病、骨骼缺陷/疾病、发育畸形及创伤等导致的骨缺损严重危害了人类的健康。如何使缺失的骨组织再生及恢复相应的功能极具挑战性。自体和同种异体骨移植治疗骨缺损的方法虽已在临床应用多年,但目前仅部分有效,而且往往伴随着大量的弊端,如供体来源有限、移植排斥反应、受体潜在的感染、疾病传播及神经血管损伤等副作用[1-3]。骨再生或骨替代策略的局限性引导着广大学者把组织工程的方法引入了骨缺损修复再生的研究中。在再生医学中,干细胞治疗已经被证实是最有效的方法之一。对于骨组织再生,常规体外扩增、收获干/祖细胞及在体内种植细胞的策略受到干细胞来源有限、供体的损伤、免疫排斥反应、潜在的致瘤性、商业化成本高及监管严格等多方面限制。相比之下,干细胞归巢技术,即利用细胞趋化因子动员、诱导宿主骨髓和组织中的干/祖细胞迁移到受伤部位是一个新的选择[4]。在各种细胞因子或趋化因子中,基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α),亦被称为趋化因子配体12(CXCL12),在骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)的归巢和定植过程中起到非常重要的作用[5]。microRNAs(miRNAs)是进化过程中保守的非编码小RNA(约22个核苷酸),参与了几乎每一个生物过程,包括干细胞增殖、分化。随着miRNAs在治疗和监测疾病过程中的应用不断增加,mirnas成为生物学和医学研究中的重要工具。众多研究证明mirnas参与干细胞成骨分化[6]。更重要的是,使用mirna基因修饰的骨髓mscs作为种子细胞,是一项很有前景的组织再生方法[7,8]。然而,mirna半衰期短、细胞吞噬性差、易被rna酶降解及血液中不稳定等不足限制了mirna在组织再生中的应用[9]。壳聚糖不仅具有低毒、低免疫原性、可降解性和良好的生物相容性等优点,还可以与带负电荷的核酸结合形成纳米复合物,包括sirna和mirna。壳聚糖纳米载体可以通过与带负电荷的细胞膜粘附及保护mirna不被内源性核酸酶降解来提高细胞对mirna的吞噬效率。壳聚糖纳米粒作为一个更安全、更经济的dna、sirna、mirna、蛋白和多肽等非病毒载体,已经获得了越来越多的关注[10,11]。壳聚糖/β-甘油磷酸钠(chitosan/β-glycerolphosphate,cs/β-gp)具有良好的生物相容性,已经被广泛应用于控释各种药物[12]。骨再生是一个复杂的生理过程,需要通过多种生物活性分子共同作用来实现,但目前大多数研究都集中在控释单一药物促进骨再生,双缓释给药体系有望在促进骨组织再生中发挥重要作用。将cs/gp凝胶同时负载sdf-1α和cth/antimir-138纳米粒植入大鼠颅骨极限缺损处,促进干细胞归巢和成骨分化,有望成为一种简洁、高效的cell-free组织工程策略。第一部分sdf-1α缓释体系的制备及评价【目的】观察cs/gp凝胶对sdf-1α缓释作用及不同时间点释放的sdf-1α生物活性。【方法】原代分离、培养大鼠骨髓mscs并对其干细胞性质进行鉴定;采用transwell的方法,检测不同浓度的sdf-1α诱导mscs的迁移效果,筛选出可以诱导mscs迁移的最佳sdf-1α浓度;检测cs/gp凝胶对400~1000ng/ml的sdf-1α缓释效果及不同时间点释放出的sdf-1α生物活性。【结果】本实验原代培养的大鼠骨髓mscs具有干细胞特性;100ng/ml的sdf-1α诱导mscs迁移的效果最佳;cs/gp凝胶可以缓释sdf-1α并保持其生物学活性。【结论】cs/gp凝胶可以控释sdf-1α并保持其活性,体外实验结果显示可促进干细胞迁移;将cs/gp凝胶控释sdf-1α体系用于诱导体内干细胞归巢、促进骨组织再生将会显示出方便、快捷等优势。第二部分cth/antimir-138纳米粒缓释体系的制备及评价【目的】观察cth/antimir-138纳米粒对大鼠mscs的转染效率及cs/gp凝胶对cth/antimir-138纳米粒的缓释效果。【方法】1.以离子交联法制备了cth纳米粒和cth/antimir-138纳米粒,通过激光粒径分析仪、透射和扫描电镜(tem,sem)及琼脂糖凝胶电泳的方法对其理化性质、载药率等进行观察。2.采用cck-8试剂盒、流式细胞仪、rt-pcr及茜素红染色的方法观察cth/antimir-138纳米粒对mscs的细胞毒性、转染效率、成骨基因表达水平及细胞外基质矿化(ecm,extracellularmatrix)的作用。3.将cth/antimir-138纳米粒加入cs/gp凝胶中,通过tem和sem观察嵌入cth/antimir-138纳米粒的cs/gp凝胶微观结构及cs/gp凝胶对不同浓度cth/antimir-138纳米粒的缓释效果。4.将1ml负载了1000pmolcth/antimir-138纳米粒的cs/gp凝胶加入transwell小室上层,通过共培养的方法观察3,7,14及21d时对mscs成骨基因表达水平的影响。【结果】1.cth纳米粒的粒径和zeta电位由cs、tpp和ha三者之间的体积比所决定的。随着ha比率的增高,cth纳米粒的粒径逐渐增大而zeta电位则稍微逐渐降低。cth纳米粒负载antimir-138后(n/p为20:1),其粒径和电位均仅有轻微的改变。cth/antimir-138纳米粒在cs:tpp:ha为1:0.15:0.1时多向分散性(polydispersityindex,pdi)值最小。tem、sem观察显示cth纳米粒与cth/antimir-138纳米粒均呈离散的球形。凝胶电泳显示cth纳米粒可以包载antimir-138并保护其不受rna酶的降解,n/p为20:1时载药率可以达到92.6%。2.50~400μg/ml的cth/antimir-138纳米粒均未显示出明显的细胞毒性。150nmcth/antimir-138纳米粒转染效率最高,并可以促进mscs成骨相关基因的表达及ecm矿化。3.扫描电镜及荧光显微镜观察显示cs/gp凝胶可以成功负载cth/antimir-138纳米粒并保持其完整性,其释放特点为:释放初期突释效果比较明显(前3d),随后进入一个相对缓慢的释放阶段,加载的cth/antimir-138纳米粒浓越高,其释放速率越快。4.cs/gp凝胶控释cth/antimir-138纳米粒体系可以持续地促进mscs成骨相关基因的表达。【结论】cth/antimir-138纳米粒可以成功地转染mscs并促进成骨相关基因的表达。cs/gp凝胶控释cth/antimir-138纳米粒体系有望进一步应用于骨组织工程。第三部分sdf-1α和cth/antimir-138纳米粒双缓释体系促进大鼠颅骨再生的体内研究【目的】观察cs/gp凝胶双缓释sdf-1α和cth/antimir-138纳米粒促进大鼠颅骨再生的效果。【方法】1.制备大鼠颅骨8mm极限缺损模型,将cs/gp凝胶分别或同时负载sdf-1α和cth/antimir-138纳米粒植入大鼠颅骨缺处。2.术后8周通过micro-ct、he和mt染色方法观察及分析颅骨再生的效果。通过免疫组化方法观察凝胶周围成骨相关蛋白的表达情况。【结果】1.micro-ct、he和masson三色(mt)染色结果表明,将cs/gp凝胶分别或同时负载sdf-1α和cth/antimir-138纳米粒组较空白对照组相比均可以促进大鼠颅骨再生。2.免疫组化结果显示,双缓释sdf-1α和cth/antimir-138纳米粒组,cs/gp凝胶周围组织强阳性表达col-1,opn和ocn,单纯cs/gp凝胶组col-1和opn弱阳性表达,opn阴性表达。【结论】1.CS/GP凝胶双缓释SDF-1α和CTH/antimiR-138纳米粒体系可以通过诱导自体干细胞归巢及提高成骨相关蛋白的表达促进大鼠颅骨再生。2.CS/GP凝胶双缓释SDF-1α和CTH/antimiR-138纳米有望成为一种简洁、高效的cell-free组织工程策略。