丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)呈广泛流行态势,全球至少有1.7亿感染者,占总人口的3%。HCV一经感染,约55%-85%的感染者会发展为慢性感染,并有较高比例的感染者最终会发展为肝硬化、肝癌。由于HCV的高度变异特性和合适实验动物模型等关键实验平台的缺乏,对丙型肝炎病毒病原学、致病机理的了解还非常不足,现有药物治疗效果不理想,保护性疫苗的应用也尚不可预期。对HCV感染的实验室检测是临床诊断、病程预测、药物疗效评价必要手段。本研究以PCR技术为基础,结合核酸分子杂交技术建立高效、特异的HCV定性检测方法；运用Taqman技术原理建立了HCV荧光实时定量PCR检测技术。首先,针对HCV保守基因序列设计了PCR引物和地高辛标记的杂交探针,扩增片段长度为678bp。PCR扩增产物经琼脂糖电泳后转移至阳离子尼龙膜上,探针杂交后进行抗地高辛碱性磷酸酶结合和化学显色,经主要反应条件和技术参数的优化,建立了以PCR-Southern杂交为核心的HCV定性检测体系。经评价认为该方法灵敏性与检测稳定性均较好,同时具有较强的普遍适用性。进而,根据Taqman荧光探针发光/淬灭原理,设计了可用于实时荧光PCR的引物、探针,所设计引物HCV 5’NCR基因区段有效扩增(146bp), Taqman荧光探针工作正常。经反应条件进行了优化,确定了最佳退火温度(60℃)、引物浓度(200nM)和探针浓度(100 nM)。构建5’NCR-C基因重组质粒为标准品,绘制了标准曲线。标准曲线的CT值与拷贝数的对数值之间有很好的相关性(R2=0.9986),建立了荧光实时定量PCR检测方法。经相关评价认为,该方法检测灵敏度高、线性检测范围宽,可对经102-108核酸拷贝标本进行有效检测；对不同基因型HCV样本(1型、3型、6型)可有效检测,适用性良好。NS3丝氨酸蛋白酶是重要的药物靶点,了解其编码基因变异特性及其对药物作用位点影响,将为以NS3丝氨酸蛋白酶为靶向药物的设计与研制提供理论依据。鉴于此,本研究完成了不同基因型的NS3基因区段核酸及氨基酸序列分析,阐明了其变异特性,其变异存在型特异性。对NS3丝氨酸蛋白酶三级结构模拟并对药物靶点区域分析,确定HCV NS3丝氨酸蛋白酶120至170位氨基酸为现有药物的主要靶标。这一区域氨基酸变异统计分析,发现除6亚型外,其他基因型变异具有型特异性。综上所述,本研究建立了适用范围宽、重复性好、灵敏度高、特异性强的HCV定性检测方法及荧光实时定量PCR检测方法,可为丙型肝炎临床诊断、病程预测、药物疗效评价及相关HCV研究提供必要的技术支持；对HCV NS3丝氨酸蛋白酶药物结合位点氨基酸变异特性的初步了解,将为以NS3丝氨基酸蛋白酶为药物靶点的新药的设计与研发提供重要参考数据。