海藻糖(Trehalose)，是由两分子的葡萄糖以α,α-1,1糖苷键连接而成的非还原性二糖，广泛存在于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物和植物中。微生物在极端条件下大量积累海藻糖来保护蛋白质、核酸和生物膜等生物活性物质。除在某些复苏植物中有较高的积累量外，海藻糖在高等植物中的积累量都极低。但是，海藻糖及其前体海藻糖-6-磷酸在胚胎发育、花序建成、细胞形态建成和信号转导方面发挥着重要的作用。转入外源海藻糖合成相关基因的植株，虽没有海藻糖的大量积累，但其耐逆性都得到了提高。过量表达内源海藻糖合成酶基因的转基因拟兰芥和水稻，耐逆性也得到了提高。因此，研究玉米内源海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase，TPS)基因家族的功能，可以解明玉米低海藻糖含量的机理，为转化利用外源TPS基因和过量表达内源TPS基因奠定基础。　　 本研究通过对已测序玉米自交系“B73”基因组BAC文库的搜索，发现玉米基因组中含有多达18个TPS基因的拷贝。将18个TPS基因拷贝在基因组序列上定位后发现，实际上只有12个碱基序列有一定差异的同源基因，根据其与酵母TPS1的同源性分别命名为TPS1～TPS12。其中，TPS3为三拷贝基因，TPS2、TPS4、TPS5和TPS11为双拷贝基因，TPS1、TPS6、TPS7、TPS8、TPS9、TPS10和TPS12为单拷贝基因。按照拟南芥TPS基因家族划分方法，将玉米的TPS基因家族划分为两个亚家族，TPS1属于Ⅰ亚家族，TPS2～TPS12属于Ⅱ亚家族。根据上述序列设计特异PCR引物，以玉米自交系“18-599”的cDNA为模板，同源扩增TPS基因家族12个成员的开放阅读框（openreadingframe，ORF）。经克隆测序和比对分析发现，扩增出其中9个同源基因。TPS1的ORF全长2820bp，编码939个氨基酸；TPS2的ORF全长2607bp，编码868个氨基酸；TPS3的ORF全长2592bp，编码863个氨基酸；TPS4的ORF全长2673bp，编码890个氨基酸；TPS5的ORF全长2739bp，编码912个氨基酸；TPS6的ORF全长2595bp，编码864个氨基酸；TPS7的ORF全长2736bp，编码911个氨基酸；TPS8的ORF全长2568bp，编码855个氨基酸；TPS9的ORF全长2556bp，编码851个氨基酸。Ⅰ亚家族的TPS1与Ⅱ亚家族的各同源基因编码蛋白的氨基酸序列相似性较低，介于33％～36％之间。Ⅱ亚家族各同源基因之间，编码蛋白的氨基酸序列相似性较高，介于51％～94％之间。其中，TPS5与TPS7的相似性高达91％，TPS8与TPS9的相似性高达94％。为验证这9个同源基因的功能，分别将9个ORF序列插入酵母表达载体pRS6，转化酵母TPS1基因突变菌株YSH290（tps1△）和TPS2基因突变菌株YSH450(tps2△)，分别在葡萄糖筛选培养基和38.6℃高温条件下筛选，进行功能互补实验。结果证明，9个TPS基因中，TPS1和TPS3编码的蛋白具有TPS活性，TPS3和TPS4编码的蛋白具有海藻糖-6-磷酸磷酸酶(Trehalo-6-phosphatephosphatase,TPP)活性。　　 将玉米自交系“18-599”的幼苗从二叶期开始进行水培，三叶期进行150mmol/LNaCl和12℃低温胁迫处理，于0（对照）、0.5、1、2、4、6、8、12、24和48h分别取根系和叶片，用实时荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR，qRT-PCR)以及逆转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)，检测上述9个TPS同源基因在逆境胁迫下的表达差异。结果表明，9个TPS同源基因在根系和叶片中的表达均受高盐和低温胁迫诱导。在高盐胁迫下，除TPS4在叶片中受到一定程度的抑制外，其他8个同源基因分别在胁迫处理的不同时间段上调表达。在叶片中，TPS1、TPS2、TPS3和TPS5分别在低温胁迫处理的不同时间段上调表达，TPS4在所有时间段下调表达，TPS6、TPS7、TPS8和TPS9在低温胁迫处理初期下调表达，在胁迫处理后期上调表达。在根系中，TPS1、TPS3和TPS4均在低温胁迫下上调表达。由此说明，玉米TPS基因家族的一些成员可能具有表达活性，参与了胁迫信号转导，所以才会对高盐和低温诱导产生应答反应。　　 在对TPS1基因的ORF重复测序中，发现不同克隆的序列组成不尽相同，推测可能存在可变剪接。因此，以高盐和低温胁迫处理24h以及0h对照的叶片cDNA为模板，重新扩增其ORF，进行大量重复测序。TPS1基因在非胁迫下产生两种剪接体：TPS1和TPS1A；在盐胁迫和低温胁迫下产生5种可变剪接体：TPS1、TPS1A、ZTPS1B、TPS1C和TPS1D。经ORFfinder和Conserveddomainanalysis软件分析，TPS1剪接体可编码TPS和TPP两个结构域，与其他高等植物中发现的TPS基因转录本编码结构域的情况相同。与TPS1相比，TPS1A的可变剪接属于内含子保留型，TPS1中的第4、7、8内含子滞留在了TPS1A成熟的mRNA中，可编码369个氨基酸的蛋白；TPS1B属于5端剪接位点的选择型，在第7内含子的剪接过程中，采用了末端剪接位点，可编码462个氨基酸的蛋白；TPS1C属于内含子保留型，滞留了TPS1中的第4内含子，可编码369个氨基酸的蛋白；TPS1D的可变剪接较为复杂，第1内含子的剪接同时采用了5’端和3’端剪接位点的选择两种形式，同时也存在盒式外显子，成熟的mRNA中不包括TPS1中的第7外显子，可编码133个氨基酸的蛋白。多序列比对分析表明，后4种可变剪接体有一个共同的特性，即将TPS1编码蛋白中融合在一起的TPS和TPP两个结构域分开，可能使其TPS结构域具有更高的催化活性。　　 综上所述，玉米TPS基因家族成员较多，大多具有转录产物，在逆境胁迫下差异表达，并存在可变剪接，编码蛋白有些具有海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性，可能参与逆境胁迫信号转导。