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目的:该研究先将绿色荧光蛋白GFP基因、分枝杆菌复制子Orim基因及胞内病原体抗性基因1(Ipr1基因)共同克隆进入双启动子真核表达的载体pBudCE4.1中,构建了pBOGI这一穿梭质粒;把pBOGI重组质粒电转化入卡介苗BCG中,获得了重组BCG疫苗;从而探讨Ipr1基因重组BCG在小鼠结核病模型中的治疗效果。本研究旨在为探索Ipr1基因增强巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的固有免疫机制奠定基础。方法:1.采用RT– PCR从小鼠C57BL/6J胸腺组织中扩增出Ipr1基因并克隆入pEGFP-C1质粒中,获得含有Ipr1基因的pEGFP- Ipr1重组质粒。2.经过严密次序的分步克隆,把GFP、Ipr1和Orim基因共同克隆进入双启动子真核表达的载体pBudCE4.1中,构建了pBOGI共表达穿梭质粒。然后用脂质体瞬时转染A549细胞,显微镜、RT-PCR、免疫细胞化学、Western Blotting检测GFP基因和Ipr1基因的表达。3.把pBOGI电转化入BCG中,获得了可靶向递送pBOGI重组质粒进入巨噬细胞并表达的重组BCG疫苗,在细胞水平和动物水平同时检测Ipr1基因的表达。4. BALB/c小鼠30只,随机分为3组(n=10);分别滴鼻给予磷酸盐缓冲液(PBS)、BCG和重组BCG,2周后用人型Mtb H37Rv标准株感染所有小鼠;感染后分别用PBS、BCG和重组BCG治疗7次;末次治疗后处死小鼠,观察肺脾组织荷菌量,肺脾脏器指数,血清IFN-γ、IL-10及TNF-α分泌水平和肺脾组织中Ipr1编码蛋白的表达,同时对比小鼠肺脾的病理变化。结果:1.从小鼠C57BL/6J胸腺组织中扩增出大小为1338bp的片段,真核表达质粒pEGFP- Ipr1构建成功。2.限制性内切酶酶切及DNA测序证实,pBOGI共表达穿梭质粒构建成功。导入A549细胞,用RT- PCR、显微镜、免疫细胞化学、Western Blotting等方法观测到了目的基因表达。3.成功构建了能靶向传递Ipr1重组质粒入巨噬细胞的重组BCG疫苗,以其滴鼻小鼠BALB/c,RT– PCR法,免疫组化观测到肺、脾组织中目的基因表达。4.重组BCG组肺脾组织荷菌量比PBS组及BCG组显著降低;重组BCG组肺脾组织脏器指数比PBS组及BCG组显著降低;重组BCG组血清IFN-γ分泌水平比PBS组及BCG组显著升高。用免疫组织化学法观测到小鼠肺脾组织中有Ipr1基因编码蛋白的表达。PBS组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛;重组BCG组肺部病变最轻,肺泡结构基本正常;BCG组病变范围局限,病变程度界于PBS组与重组BCG组之间;各组之间比较脾组织病理改变不甚明显。结论:1.绿色荧光蛋白GFP基因、分枝杆菌复制子Orim基因和Ipr1基因在小鼠的巨噬细胞内实现了共表达。2.携带外源治疗性基因的重组卡介苗成功地构建,并具有良好的靶向巨噬细胞特性。3.携带小鼠Ipr1基因的重组BCG对结核分枝杆菌感染有一定的治疗作用。4.携带小鼠Ipr1基因的重组BCG作为新型的结核病治疗性活疫苗具良好的开发和应用价值。