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水稻细菌性基腐病由菊欧氏菌玉米致病变种(Erwinia chrysanthemi pv.zeae,简称Ecz)引起,在我国大部分地区及东南亚许多国家都有发生,是近二十年来水稻上重要的细菌病害之一,严重危害水稻的产量。目前对该病原细菌的致病性调控机理研究极少。
本论文以水稻基腐病细菌Ecz为研究材料,通过Tn5插入与软腐欧氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora,简称Ecc)双组分调控系统ExpS/ExpA同源的expA而使该基因失活,克隆expA基因,并进行功能互补和基因表达分析。研究ExpA调节蛋白所调控的致病因子,包括果胶酶、蛋白酶、毒素、细菌的运动性、烟草HR反应和在水稻上的致病力等,并进一步研究ExpA调节蛋白对细菌群体感应的影响。
Tn5插入研究结果表明,expA基因突变体Ep87,丧失了在寄主水稻上的致病性和烟草上的HR。
通过致病因子活性测定,结果表明,expA基因突变体具有减少Ecz病原细菌的运动性,降低果胶酶和蛋白酶活性,以及不产生毒素的能力,同时也影响细菌的群体感应。由此说明,反应调节蛋白ExpA可调节Ecz细菌运动性、胞外水解酶和毒素等致病因子,并与细菌的QS系统有关。
通过基因互补、基因表达和功能验证试验,获得了expA基因功能互补体,证明了expA是一个重要的致病性调节基因,ExpA是Ecz细菌致病性的重要调节因子。
通过RT-PCR基因表达分析,结果表明,在玉米致病变种Ecz细菌中,expA基因与软腐细菌Ecc参与抗生素和胞壁降解酶的转录激活因子同源性的hor基因之间,彼此不存在调控关系。
通过与ExpS同源的受体激酶蛋白(sensorkinase)结构保守区的blast搜索比较,设计引物,用该引物能从Ecz细菌中PCR扩增同源性的expS基因,大小为1942bp,编码646个氨基酸,为双组分调控系统中的一个受体激酶蛋白。进一步的序列分析及NCBI Blast搜索,结果表明,来自Ecz细菌中的expS基因序列与Ecc中的sensor/regulator protein RpfA(rpfA)基因具有78%同源性(U62023.1),与Erwinia carotovora中的expS基因具有77%同源性(Y13670.1)。上述结果表明,本研究已经获得了Ecz双组分调控ExpA/ExpS的受体蛋白的部分基因序列,为进一步研究ExpA/ExpS在Ecz致病性中的调控分子机理奠定基础。
本论文结果为进一步了解水稻基腐病菌的致病因子和从分子水平上进一步明确菊欧氏菌玉米致病变种细菌的致病机理及其信号调控机制,完善植物病原细菌的致病性综合调控网络奠定了基础,也为其它病原细菌双组分调控系统的研究提供了有价值的信息。