目的：毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAChRs)是鸟核苷酸结合蛋白(G-蛋白)偶联受体(GPCRs)超家族的成员,具有该家族特征性的分子结构和跨膜信号转导方式.GPCRs通过兴奋偶联的G-蛋白,促使GTP替换GDP,Gα-GDPβγ异三聚体解离成Gα-GTP和Gβγ亚单位,活化G-蛋白.由mAChRs参与的跨膜信号转导系统同样由受体、G-蛋白和效应蛋白(effector)构成.m1、m3和m5亚型与G-蛋白中的Gqα或G0α偶联,激活下游的效应蛋白-磷脂酶C(PLC);m2和m4亚型与Giα偶联,抑制腺苷酸环化酶(AC)的活性.GPCRs与G-蛋白的融合蛋白表达系统具有如下优点而适用于多种GPCRs的研究,即融合蛋白使信号转导分子间具有精确的1:1化学定量关系及相互彼邻的空间位置,并使Gα紧紧锚定在细胞膜上.由于该融合蛋白具有高效偶联、不受内源性G-蛋白影响的特点,为融合蛋白配体结合功能和信号转导机制及影响因素的研究奠定了分子基础.该研究采用分子生物学技术,利用Baculovirus-insect-cell(Sf9 cells)系统构建和表达m4AChR-Gilα融合蛋白,检测在配体的作用下,m4AChR-Gilα融合蛋白的功能及信号转导时分子间相互作用的机制和影响因素.寻找m4AChR亚型特异性新药,从而有助于解决由于缺乏特异性配体导致的m受体药理学分型落后于分子生物学分型的问题,并为开发和研究有临床价值的M受体亚型特异性新药奠定基础.结论1.采用GPCR-G-蛋白融合蛋白技术,通过Baculovirus-insect-cell系统可以表达m4AChR蛋白和m4AChR-Gilα融合蛋白.并通过实验证明两者都具有m受体配体结合特性,且m4AChR-Gilα融合蛋白两组分m4AChR与Gilα间保持着非常好的活性偶联功能.2.m4AChR-Gilα对GDP的亲和性决定于和代表着m4AChR配体的性质,完全激动剂使亲和力降低;部分激动剂次之;拮抗剂使亲和力增高.通过分析配体引起的GDP亲和性的变化可以判断配体的种类和特性,有助于筛选和鉴别m4AChR亚型特异性药物.3.m4AChR-Gilα对GTP的亲和性亦下降,但降低辅度小于GDP;ATP对[35S]GTPγS与m4AChR-Gilα替代结合作用无影响.4.m4AChR-Gilα与低亲和性GDP结合需要Na+或K+离子的参与.5.激动剂、m4AChR、Gilα和Na+或K+构成的复合体是GTP-GDP交换反应的中间状态.