背景:结直肠癌是最常见的消化道肿瘤之一。在我国,随着生活方式、饮食结构改变、人口老龄化等诸多因素影响,结直肠癌发病率近年来呈明显的上升趋势,防治形势仍十分严峻。而肿瘤的复发和转移是其死亡的主要原因。肿瘤干细胞因其自我更新、无限增殖潜能、独特的耐药机制等特性被认为是肿瘤产生和发展的元凶。而上皮-间质转化(EMT)是肿瘤向外侵袭和转移的重要方式。近几年研究发现,肿瘤干细胞与EMT关系密切。在实验模型中,EMT使肿瘤细胞获得侵袭和转移表型、耐受药物攻击并具有肿瘤干细胞表型。发生EMT的细胞上皮相关蛋白如E-钙黏蛋白降低,而间质相关的转录因子Snail、Twist及相关蛋白波形蛋白、纤连蛋白等则升高。肿瘤细胞通过EMT,其黏附力减弱,运动性增强,可向远端侵袭及转移。通过药物诱导或高表达EMT相关转录因子可使细胞发生EMT改变,而这些细胞可表现出肿瘤干细胞的特点;另一方面,富集的肿瘤干细胞具备EMT细胞的表型和特点。因此,EMT被认为是肿瘤干细胞的特性之一,通过EMT肿瘤干细胞可实现侵袭和转移。然而,由于EMT是一个快速的转化过程,目前所观察到的结果多是从体外实验或动物模型中获得,真实肿瘤中发生的EMT及其在肿瘤中的作用仍有待证实。肿瘤的发生、发展除了细胞具备自身增殖、侵袭、转移所需要的特性外,还必须能躲避机体的免疫监视机制才能最终生存,而目前关于肿瘤干细胞的免疫逃逸机制尚不清楚。有研究发现肿瘤免疫逃逸与EMT有关,通过诱导EMT而形成的肿瘤中伴随大量调节性T细胞(Treg)的浸润和树突状细胞(DC)的功能受损。综上分析,推测肿瘤免疫逃逸对于发生EMT侵袭、转移的肿瘤干细胞躲避免疫系统的监视、清除并最终形成肿瘤具有重要的意义。B7H1是重要的起负向调控作用的共刺激因子,是程序性死亡受体PD-1的配体。肿瘤细胞高表达的B7H1可与淋巴细胞上PD-1结合而使淋巴细胞失能,从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。然而,B7H1在结直肠癌干细胞中的表达及其与EMT的关系并不清楚。因此,在本课题中,拟通过CD133分子对结直肠癌干细胞进行分选鉴定,并对其在肿瘤组织中的分布特点及其EMT表型与B7H1的表达特点进行检测,了解肿瘤干细胞免疫逃逸的可能机制及其与emt的关系。此外,通过ifn-γ上调b7h1表达进一步检测b7h1表达变化对不同肿瘤细胞亚群干细胞相关表型和功能的影响。方法:(1)在结肠癌细胞株ht29中以cd133分子为标记,通过磁珠分选得到不同的cd133+、cd133-细胞亚群,比较两群细胞在nod/scid小鼠中的成瘤能力、无血清培养基中的成球能力有无差别。此外,通过q-pcr的方法检测两群细胞其他干性相关分子oct-4、sox-2的表达情况,并检测emt相关转录因子twist、snail及相关蛋白e-钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白的表达情况,以检测分选到的cd133+细胞是否同时高表达其他干性分子并具有emt的表达特点。(2)收集结直肠癌手术标本,制备冰冻切片。通过免疫荧光染色检测结直肠癌组织中cd133在各期肿瘤中的分布情况,epcam分子用于区分肿瘤细胞及间质细胞。此外,通过cd133分子与e-钙黏蛋白、波形蛋白在同一切片中染色,并用激光共聚焦显微镜同时观察几个分子的表达情况,以检测cd133+细胞的emt表型。(3)通过免疫荧光染色检测ht29细胞及结直肠癌组织中b7h1与cd133的表达情况,分析b7h1在各期肿瘤中的表达特点。此外,检测b7h1阳性细胞中e-钙黏蛋白、波形蛋白的表达情况。(4)通过在培养体系中加入ifn-γ上调b7h1表达,检测ht29细胞cd133表达及emt表型的变化,并检测不同cd133+、cd133-细胞亚群成瘤能力的改变,分析细胞因子作用上调b7h1表达后对肿瘤干样细胞干性表型及功能的影响。研究结果:(1)通过优化的磁珠分选方法,分选得到相应的cd133+、cd133-细胞亚群,细胞纯度在80%以上。cd133+细胞与cd133-细胞相比,在nod/scid小鼠体内成瘤能力、无血清培养基中成球能力均显著增强,且高表达干性因子oct-4及sox-2,高表达emt相关转录因子snail、twist,间质细胞相关标志波形蛋白、纤连蛋白,而低表达上皮细胞相关标志e-钙黏蛋白。分选得到的cd133+ht29细胞具有干细胞相关的表型和特点,并且相关基因的表达符合emt相关改变。(2)在结直肠癌组织中,伴随组织tnm分期的增加,cd133总体表达水平呈上升趋势。cd133表达于epcam+的肿瘤细胞上;此外,部分cd133+肿瘤细胞e-钙黏蛋白表达降低而出现波形蛋白表达,呈现emt的表型改变。(3)在ht29细胞及结直肠癌组织中,b7h1与cd133分子存在共表达的情况。B7H1分子在肿瘤组织中的表达比较复杂,收集的20例组织中,其中13例主要表达于肿瘤细胞上,该部分组织中B7H1与CD133的共表达现象普遍,且部分B7H1+细胞具有EMT的表型特点。而有6例组织中B7H1主要在间质细胞上表达,其中部分为CD3+T细胞。(4)IFN-γ作用后HT29细胞B7H1表达增加,细胞呈现梭形的EMT特征,但CD133表达阳性率下降。进一步用IFN-γ作用于不同的CD133+及CD133-细胞亚群,发现处理后CD133+细胞的成瘤能力没有降低,但CD133-细胞亚群的成瘤能力则显著增高。通过检测IFNg R1、IFNg R2,发现IFN-γ作用后其受体mRNA水平在两亚群细胞中均增高,其中IFNg R1的增高有显著差异。此外,PCNA在作用后两群细胞中增高明显,提示了IFN-γ作用后可能增强了CD133-细胞亚群的增殖能力,使其在小鼠体内肿瘤生长速度较快。结论:(1)以CD133为标志分选到肿瘤细胞具有肿瘤干细胞的特点。(2)CD133在结直肠癌中的表达与肿瘤TNM分期有关,部分CD133+细胞具有EMT表型特点。(3)B7H1与CD133存在共表达情况且部分B7H1+细胞具有EMT表型特点,推测上调B7H1可能是肿瘤干细胞免疫逃逸的机制之一。(4)IFN-γ作用后肿瘤细胞B7H1上调表达并发生EMT形态改变而CD133表达则下降。IFN-γ短期处理后没有降低CD133+细胞的成瘤能力,但CD133-细胞成瘤能力明显增强,提示细胞因子作用可以改变不同亚群细胞的干性表型及功能,并有可能使非肿瘤干细胞向干细胞方向转化。