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胰岛素和类胰岛素生长因子在促进有机体的细胞增殖、分化和生长发育等方面起到关键的作用。家蚕(Bombyx mori)作为一种重要的模式生物,在2003年已经完成全基因组的测序,因此利用家蚕作为材料研究类胰岛素的功能很方便。在无脊椎动物中,最先在家蚕中鉴定到类胰岛素多肽,并最终被命名为家蚕素,后在无脊椎动物果蝇、蚊子、蝴蝶和蜜蜂中相继鉴定到类胰岛素多肽的存在。 到目前为止在家蚕基因组中,共鉴定到38种家蚕素基因和1种家蚕类胰岛素生长因子多肽(BIGFLP)基因,家蚕素共分为12个家族,分别是家族A-G和V-Z,其中家族A、B、C和V分别有10个、12个、6个和2个成员,而其它家族都只有1个成员。有关家蚕素的研究主要集中在基因水平上,而有关蛋白水平和家蚕体内发挥的生理学功能的研究知之甚少。本文研究的主要内容和结果如下: (1)生物信息学分析发现,BmILP基因全长4127bp,定位于家蚕基因组的1号染色体上,包括5′-UTR、3′-UTR、2个内含子、3个外显子和339bp的开放阅读框(ORF),共编码112个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量约12.6kDa,从第1个氨基酸开始的15个氨基酸预测为一段信号肽序列,且该信号肽序列的mRNA5′端会形成复杂的次级结构。BmILP与家蚕素家族成员的氨基酸相似性分析发现,BmILP与家蚕素Z1属于同一种多肽,家蚕素B3与B12属于同一个多肽。氨基酸保守性分析表明BmILP与家蚕素在进化上非常保守,在相似的位置都存在半胱氨酸残基,说明半胱氨酸对BmILP蛋白高级结构的形成至关重要。基序预测发现BmILP包含有两个基序,与家蚕素家族成员同样高度保守。 (2)根据BmILP基因的ORF序列设计引物扩增基因片段,利用pET-30a(+)表达质粒在大肠杆菌 BL21中,诱导表达全长和去信号肽 BmILP基因的编码序列,发现信号肽对基因的表达存在很大的影响,会降低蛋白的表达量,推测是信号肽的mRNA5′端形成的复杂次级结构抑制了氨基酸的翻译起始。通过对表达的融合蛋白进行纯化和透析复性之后,经质谱鉴定和蛋白浓度的测定,免疫小鼠制备BmILP的多克隆抗体。 (3)利用实时荧光定量PCR对家蚕五龄各组织、不同发育阶段的BmILP基因的转录时相分析发现,BmILP基因在家蚕的不同发育阶段和各组织都有表达,其中在卵巢的转录水平最高,其次是脂肪体,在头部、丝腺、中肠、精巢和马氏管表达量都比较低。此外在雌蛾中的转录水平要高于雄蛾,且在交配过的雌蛾中转录水平最高,表明BmILP可能在家蚕卵的成熟过程中是个关键调控因子。 (4)通过His-tag pull down蛋白互作实验发现,BmILP可能与家蚕自噬相关蛋白Atg8存在相互作用,表明BmILP可能参与了家蚕的免疫反应。此外利用制备的BmILP多克隆抗体,进行免疫沉淀(IP)实验,发现在真核细胞中BmILP多肽可能形成了多聚体,但还需要进一步的实验验证。 (5)利用RNA干扰技术对BmILP基因进行干扰,经实时荧光定量PCR检测 RNA干扰成功,发现 BmILP基因在24h后转录水平开始下降,一直持续到72h,到96h的时候又恢复正常。实验结果显示从72h到96h BmILP基因转录表达水平开始上升的时候,血淋巴总糖的含量在下降,但是并不会影响到体重的变化,表明BmILP能降低家蚕血淋巴中总糖的含量,因此推测BmILP可能参与了家蚕的糖代谢过程。