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茯苓(Wolfiporia cocos)是一种药食两用真菌,以干燥菌核入药,具有健脾和胃、渗水利湿、宁心安神等功效。其中茯苓酸是其主要质量指标成分和医药活性成分。在我国药用历史悠久,始载于《神农本草经》,谓中药中之上品。大量药理学研究表明茯苓酸具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化作用,以及降血糖、镇静等功效。目前砍伐松木作为培养料栽培茯苓,随着茯苓需求量的增加对森林资源的消耗日益严重,茯苓生产和森林保护的矛盾日益尖锐。运用生物工程技术,通过茯苓菌丝发酵来生产茯苓酸以及代料栽培茯苓成为茯苓产业可持续发展新途径。而研究茯苓酸的生物合成途径及代谢调控为使用生物工程技术和代料栽培技术生产茯苓或茯苓有效成分提供理论基础。本研究在运用液相色谱-质谱定性分析茯苓菌核中三萜类物质成分的基础上,根据其化学结构式,推导出了茯苓酸可能的生物合成途径。根据该途径,结合本课题组前期进行的转录组测序及参考已公布的茯苓基因组数据库及KEGG、NCBI等公共数据库,注释到了相关的催化酶及编码基因。其中注释到Wcsoat可能催化土莫酸生成最终产物茯苓酸。本研究针对该基因,在转录组测序获得基因片段基础上,克隆得到了该基因全长,并进行了相关功能分析,了解该基因的基本特征,分析了该基因可能的功能。研究结果对进一步完成解析茯苓酸的生物合成途径提供了方法学借鉴和奠定了一定的基础。具体研究结果如下:1.提取茯苓总三萜,对三萜物质定性分析,鉴定了11种三萜化合物,包括茯苓酸、羊毛甾醇、氢化茯苓酸、齿孔酸、土莫酸等,通过化学结构式分析得推导出了茯苓酸合成途径,注释了相关催化酶及编码基因,其中甾醇氧乙酰基转移酶催化土莫酸生成茯苓酸。2.从茯苓中克隆得到了SOAT基因Wcsoat,并进行序列分析。得到了完整的CDS编码区,全长为1839 bp,编码612个氨基酸,氨基酸序列中没有蛋白水解酶。该蛋白为不稳定的疏水蛋白质,且不具有信号识别功能。该基因编码的蛋白质是有着7段跨膜区的膜蛋白,属于膜结合氧乙酰基转移酶超家族,大小约为68 kDa。3.构建超表达载体pBlueScript SK-Wcsoat,通过PEG介导的原生质体转化方法成功转化到茯苓菌株GIM5.219中,获得了三株超表达菌株OE-1、OE-2、OE-3,三株超表达菌落生长速度和菌丝生长型态都发生了明显变化,其中OE-1菌株的Wcsoat表达量是野生型的5.44倍,且菌丝的生长速度高于其他菌株,OE-2的菌丝长势明显好于其他菌株,菌丝生长浓密,且可以进行液体发酵培养而不褐化。在不加MeJA的条件下,超表达菌株的茯苓酸含量均高于野生型。初步推测Wcsoat参与了茯苓酸的合成,但是其功能需要进一步验证。4.构建分泌型真核表达载体pPICZα-Wcsoat,并转化到毕赤酵母X33菌株中,甲醇诱导目的蛋白表达,获得了与预期大小一致的蛋白,为下一步开展体外酶促反应打下了基础。