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奶牛乳腺炎是乳腺组织受到物理,化学,微生物等刺激引发乳腺病变,对奶牛养殖业造成巨大损失。对奶牛乳腺炎发病机理和防治技术的研究已有一个多世纪,大多是从乳腺炎表型症状出发,探寻一些合理的管理技术和防治手段,虽然取得一些疗效,但仍未能从根本上解决奶牛乳腺炎的发生和彻底的控制。本研究拟从基因遗传角度出发,探寻奶牛抗乳腺炎的新方法,试图找到与奶牛乳腺炎抗性相关的基因,研究和分析某基因在奶牛乳腺炎发病中的作用及表达调控的分子机制。1Clusterin基因SNP检测及其与奶牛乳腺炎的相关性分析本研究测序发现在CLU基因的5’调控区,编码区,3’非翻译区都存在SNP,通过分析不同SNP与1000多头中国荷斯坦牛产奶量,乳脂率,乳蛋白率,体细胞数评分,脂蛋比,总奶量,总乳脂,总乳蛋白等产奶性能的相关性,从多态效应,基因替换效应,单倍型组合效益,胎次效应来分析和探讨CLU基因与乳腺炎的相关性。根据实验研究发现,CLU基因在中国荷斯坦牛群体内的遗传变异较低,处于中度多态,突变产生正效应占优势,产奶性能优良的单倍型组合H1H4在牛群中数量不占优势,胎次效应为正,但产奶性能提高的同时伴随体细胞评分的上升,尤其是第四胎牛,产奶性能上升速率趋于平缓,但体细胞评分却偏高。+17301T突变可作为抗奶牛乳腺炎的遗传标记辅助选择指标。2Clusterin基因乳腺特异启动子构建及功能验证本研究克隆获得不同长度片段的CLU基因5’调控区序列,生物信息分析不同片段都含有启动子特有的TATAbox,转录因子结合位点和CpG岛。将不同长度片段的CLU基因5’调控区序列分别导入PGL3-Basic荧光素酶表达载体后转染293T细胞发现,CLU基因5’调控区的F1启动子活性很弱,且C-994T突变对F1启动子影响不明显,F2启动子具有很强的启动子活性。然后利用F2启动子高活性的特点,分别构建了包含不同启动子的CLU基因表达载体pEGFP-N1-CMV-CLU, pEGFP-Nl-F2-CLU和pEGFP-N1-CMV-F2-CLU,转染293T细胞和乳腺上皮细胞后发现pEGFP-N1-F2-CLU和pEGFP-N1-CMV-F2-CLU都可以激发CLU基因的表达,并且在293T细胞中的活性要高。而复合启动子表达载体pEGFP-N1-CMV-F2-CLU在293T细胞和乳腺上皮细胞中激活CLU基因表达的能力最强,且明显观察到CLU基因在细胞质中表达。3奶牛乳腺组织中Clusterin基因的可变剪切体鉴定及表达本研究乳腺炎致病菌分离鉴定为金黄色葡萄球菌,克隆测序发现在乳腺炎乳腺组织中发生内部外显子剪切,实行可变剪切模式,形成两种亚型X-CLU和Y-CLU。编码区SNP导致高频剪切位点消失和CLU基因mRNA二级结构发生剧烈变化。CLU基因乳腺组织体内表达显示,X-CLU和Y-CLU在正常乳腺组织和乳腺炎乳腺组织中的表达量差异显著,X-CLU在乳腺炎乳腺组织中mRNA表达量上调。在6个正常乳腺组织和6个乳腺炎乳腺组织中都出现了80kDa的蛋白条带,但是在第二个正常乳腺组织和第一个乳腺炎乳腺组织中出现了60kDa的蛋白条带。构建的CLU基因复合启动子表达载体pEGFP-N1-CMV-F2-X-CLU和pEGFP-N1-CMV-F2-Y-CLU分别转染乳腺上皮细胞进行乳腺组织体外表达显示只检测到X-CLU的mRNA表达,且蛋白分子量约60kDa,而Y-CLU没有表达。80kDa的蛋白可能是机体适应某种环境伴随X-CLU和Y-CLU两种蛋白的相互作用而形成的蛋白复合体。4Clusterin基因3’UTR靶标确证奶牛乳腺炎抗性相关microRNA本研究在CLU基因3’UTR区发现3个突变位点,生物信息分析发现+17301T缺失突变对miRNA的结合情况起关键作用。生产性能相关性研究显示+17301T突变与乳腺炎成正相关。CLU基因3’UTR在+17301T突变前结合bta-miR-2373,但T缺失后不结合。本研究中心基因芯片结果显示在中国荷斯坦牛乳腺炎乳腺组织中bta-miR-2373表达下调4.0倍。因此选择bta-miR-2373作为乳腺炎相关miRNA进行研究,实验证明,miRNA前体表达克隆载体CCS-bta2373-MR04在293T细胞中过表达,与CLU基因3’UTR靶标表达克隆载体pMIR-REPORT-miRNA-PT共转后,两者几乎完全结合,从而抑制CLU基因表达,CCS-bta2373-MR04也可以部分结合pMIR-REPORT-miRNA-PT-SNP降低CLU基因表达。因此,在乳腺炎发病过程中,降低内源性bta-miR-2373的表达,可上调CLU基因表达量,增强奶牛乳腺炎抗性。所以说,bta-miR-2373参与奶牛乳腺炎的发生和发展,可作为奶牛乳腺炎抗病育种的选择指标。