目的:脑胶质瘤是人脑部最常见及原发性的恶性肿瘤,目前治疗脑胶质瘤的方法是手术切除,结合术后放疗和化疗。血肿瘤屏障(blood tumor barrier,BTB)极大地限制了大多数的化疗药物进入肿瘤组织中,降低了化疗的疗效。因此,选择性开放BTB以增加脑肿瘤组织中的药物浓度对于提高化学疗法治疗恶性神经胶质瘤的有效性至关重要。PIWI(P-element-induced wimpy testis)蛋白属于Argonaute(AGO)家族,参与癌症发生的生物学过程。PIWI蛋白识别并结合PIWI相互作用RNA(piRNA),构成piRNA诱导的沉默复合体(piRISC),在表观遗传调控、转座子沉默等发挥重要的作用。PIWIL1(Piwi‐like RNA‐mediated gene silencing 1)是PIWI蛋白家族中的一员,能促进胶质瘤的增殖、迁移和抑制其凋亡。然而,PIWIL1在人脑微血管内皮细胞中的表达及功能,目前尚未见报道。PiRNAs(Piwi-interacting RNA)是长度为23-32个核苷酸(nt)的非编码RNA。最近研究表明,piRNAs在癌症的发生发展过程中发挥重要的作用,可作为治疗癌症的分子靶标。piR-DQ593109的功能尚未见报道。RNA结合蛋白(RNA binding proteins)调控细胞的生物学过程,包括RNA的剪接、稳定性、降解和翻译。RBFOX1是RBFOX家族成员,在大脑、心脏和骨骼肌中选择性表达并与多种肿瘤的发生相关。研究表明,在中枢神经系统疾病,如癫痫、自闭症等患者中发现RBFOX1的缺失。RBFOX1在多形性胶质母细胞瘤中低表达。但是RBFOX1在人脑微血管内皮细胞中表达与功能尚未见报道。本研究旨在探讨PIWIL1/piR-DQ593109、RBFOX1在胶质瘤内皮细胞中的表达水平,并阐明PIWIL1/piR-DQ593109及RBFOX1在调控血肿瘤屏障通透性的作用和分子机制,从而为胶质瘤的治疗提供新的策略。研究方法:1.构建体外血脑屏障(blood brain barrier,BBB)模型和体外BTB模型;2.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PIWIL1、pi R-DQ593109、MEG3、miR-330-5p、RUNX3、RBFOX1、LINC00673、MAFF的表达水平;3.Western blot检测PIWIL1、RUNX3、RBFOX1、MAFF、ZO-1、occludin、claudin-5的表达水平;4.在胶质瘤微血管内皮细胞(GECs)中分别稳定转染PIWIL1沉默质粒、MEG3过表达质粒、RUNX3过表达质粒、RUNX3沉默质粒、RBFOX1过表达质粒、RBFOX1沉默质粒、LINC00673过表达质粒、LINC00673沉默质粒、MAFF过表达质粒、MAFF沉默质粒;在GECs中瞬时转染piR-DQ593109沉默物,agomir-330-5p、antagomir-330-5p;5.跨内皮电阻值(TEER)实验检测BTB的完整性;6.辣根过氧化物酶(HRP)实验检测BTB的通透性;7.免疫荧光技术检测ZO-1、occludin和claudin-5的表达和分布;8.双荧光素酶报告基因检测并验证piR-DQ593109与MEG3、MEG3与mi R-330-5p、miR-330-5p与RUNX33’UTR、RUNX3与ZO-1、occludin、claudin-5,LINC00673与MAFF、MAFF与ZO-1、occludin、claudin-5的结合作用及结合位点;9.RNA结合蛋白免疫沉淀实验检测piR-DQ593109、MEG3与PIWIL1的结合作用,MEG3、miR-330-5p与Ago2的结合作用,LINC00673与RBFOX1的结合作用,LINC00673、MAFF与STAU1的结合作用;10.染色质免疫共沉淀(ChIP)实验检测RUNX3与ZO-1、occludin和claudin-5启动子区的结合作用,MAFF与ZO-1、occludin和claudin-5启动子区的结合作用;11.流式细胞检测技术检测BTB开放及应用情况。结果:1.PIWIL1、piR-DQ593109在GECs中高表达,分别沉默PIWIL1和piR-DQ593109以及双沉默PIWIL1/piR-DQ593109复合物显著降低了TEER值、增加HRP渗透量并显著降低了GECs中的ZO-1、occludin和claudin-5蛋白表达,同时改变了ZO-1、occludin和claudin-5在细胞膜上由连续性变为不连续性分布。2.MEG3在GECs中低表达,过表达MEG3显著增加了BTB通透性,且MEG3以序列特异性的方式介导了PWIL1/piR-DQ593109复合物对BTB功能的调控。3.在GECs中,miR-330-5p是MEG3的下游靶标,在过表达MEG3的GECs中过表达miR-330-5p显著逆转了单独过表达MEG3对TEER值的抑制、对HRP渗透量的促进,以及降低ZO-1、occludin和claudin-5表达的作用。4.在GECs中miR-330-5p负性调控下游靶标RUNX3的表达,双过表达mi R-330-5p和RUNX3显著逆转了单独过表达miR-330-5p对TEER值的抑制、对HRP渗透量的促进,以及降低ZO-1、occludin和claudin-5表达的作用。5.RUNX3靶向结合紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的启动子区,降低其启动子的活性。6.在GECs中,RBFOX1低表达,过表达RBFOX1显著降低了TEER值、增加HRP渗透量并显著地降低GECs中的ZO-1、occludin和claudin-5蛋白表达,同时改变了ZO-1、occludin和claudin-5在细胞膜上由连续性变为不连续性分布;沉默RBFOX1的表达则呈现相反的结果。7.在GECs中,LINC00673高表达,沉默LINC00673的表达显著降低了TEER值、增加HRP渗透量并显著地降低GEC中s的ZO-1、occludin和claudin-5蛋白表达,同时改变了ZO-1、occludin和claudin-5在细胞膜上由连续性变为不连续性分布;过表达LINC00673则呈现相反的结果。8.在GECs中过表达RBFOX1显著降低了LINC00673的稳定性,LINC00673参与了RBFOX1对BTB通透性的调控。9.LINC00673通过SMD方式下调下游靶基因MAFF的表达,且MAFF参与LINC00673对BTB通透性的调控。10.在GECs中,过表达MAFF显著增加了BTB通透性,而沉默MAFF的表达则呈现出相反的结果。11.MAFF结合ZO-1、occludin和claudin-5的启动子区并降低其转录活性。12.分别过表达RBFOX1、沉默LINC00673以及共转染过表达RBFOX1和沉默LINC00673联合抗肿瘤药物阿霉素(Dox)促进了胶质瘤细胞的凋亡。结论:1.PIWIL1通过PIWIL1/piR-DQ593109途径降低MEG3的表达进而调控BTB通透性。2.MEG3通过靶向结合miR-330-5p降低RUNX3的表达调控BTB通透性。3.RUNX3分别与ZO-1、occludin和claudin-5的启动子区进行直接地结合,转录抑制其表达,调节BTB通透性。4.PIWIL1/piR-DQ593109/miR-330-5p/RUNX3信号轴在调节BTB通透性中发挥重要作用。5.RBFOX1通过降低LINC00673的稳定性增加BTB通透性。6.LINC00673通过SMD途径减弱对MAFF mRNA的降解促进MAFF对紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的转录抑制增加BTB通透性。7.RBFOX1/LINC00673/MAFF信号轴在调节BTB通透性中发挥重要作用。