论文部分内容阅读
血脑屏障（BBB）是由脑微血管内皮细胞（BMECs）在星状神经胶质细胞等细胞诱导下共同组成的一个复杂系统,是对分子进入脑内起选择作用最重要的屏障。BMECs在结构上与外周毛细血管内皮细胞不同,它连接紧密,缺乏孔道,胞饮泡、吸收外排蛋白以及代谢酶少,这些特性使得BBB选择性地限制药物进入CNS。因此,越来越需要建立一个简单、应用广泛的体外方法来预测中枢神经系统药物透过BBB的特性。MDCK细胞系为马丁达比狗肾上皮细胞,现已作为BBB体外模型用于研究药物被动透过和膜转运的细胞系。MDCK-MDR1细胞系是由MDCK细胞稳定转染人源MDR1基因,过表达极性化分布的P-gp的细胞系。与这个转染后的细胞系相比,MDCK细胞中的内源性转运体可以忽略,因此它可用于研究P-gp介导的转运实验。MDCK-MDR1细胞模型是用于测定新化学实体CNS透过性的理想BBB体外快速筛选模型,可用于指导药物的发现。因此该细胞系是预测药物大脑分布,以及判断药物进入BBB是通过被动扩散还是经P-gp主动外排机制的一个有效模型。1 P-gp高表达MDCK细胞系的建立为建立能稳定表达人源P-gp的MDCK转基因细胞系,并鉴定其是否适用于药物转运实验。将质粒pcDNA3.1（+）/MDR1通过LipofectamineTM 2000转染试剂转染犬肾上皮细胞MDCK,经G418筛选获得抗性克隆。通过P-gp的荧光底物Rho123在各单克隆细胞内的积聚量以及维拉帕米存在时细胞内Rho123积聚量检测P-gp的活性。RT-PCR和Western blot检测人源MDR1的mRNA和P-gp表达量。应用筛选出的MDCK-MDR1单克隆细胞株,研究了Rho123在MDCK和MDCK-MDR1细胞中的转运及四种经典抑制剂（维拉帕米、环孢素、酮康唑和奎宁）对Rho123转运的抑制特性。RT-PCR和Western blot检测表明,所建立的MDCK-MDR1细胞与MDCK细胞相比,经转染后MDCK细胞（MDCK-MDR1）内的人源MDR1的mRNA和P-gp表达发生从无到有的变化。Rho123在MDCK和MDCK-MDR1中的外排率分别是5.94和15.45,抑制剂能显著地抑制细胞外排作用。因此,转染后的细胞高表达P-gp,适用于研究药物的肠道和血脑屏障转运实验。2血脑屏障药物透过的快速筛选2.1 BYYT系列化合物的透过性研究BYYT是一系列乙酰胆碱酯酶抑制剂,是用于治疗阿尔茨海默病的一类药物,此类药物的疗效与其在CNS分布情况密切相关,但是它们是否能透过BBB进入CSN尚未确定。本实验主要是利用MDCK和MDCK-MDR1细胞作为BBB的体外模型研究四种BYYT化合物的转运透过特性。通过检测BYYT在MDCK和MDCK-MDR1单细胞层上的双向转运以确定它们是否为P-gp的底物或是抑制剂。应用HPLC定量分析BYYT,测定在10、50、100μmol/L时BYYT的表观透过系数(Papp),考察BYYT（1-200μmol/L）对Rho123在MDCK和MDCK-MDR1细胞上转运的影响。结果显示,BYYT在两种细胞上的跨膜转运并无显著性差异,净外排率都小于2,它们并不是P-gp的底物,Papp（A-B）值在0.94-2.41×10-5cm/s范围之间。另外四种BYYT对P-gp介导的Rho123转运都有抑制作用,IC50分别为49.43、39.81、54.08和43.85μmol/L。实验证明,多药耐药功能对BYYT系列化合物的吸收和大脑分布不受P-gp影响,易透过BBB进入大脑。BYYT与P-gp相互作用的药理活性结构部位很可能是二甲氧基茚酮。2.2天麻素及其苷元的透过性研究为了评价GAS和天麻素苷元HBA透过CNS的能力和在BBB中是否发生由P-gp介导的外排,测定了两者在MDCK和MDCK-MDR1细胞上的透过情况。我们应用体外模型测定GAS和HBA在BBB的透过率,采用HPLC检测方法检测两种化合物浓度为100、150和200μmol/L时在MDCK和MDCK-MDR1单细胞层上的透过量。测定P-gp的两种抑制剂维拉帕米和CsA对100μmol/L GAS的抑制作用,以及研究GAS和HBA在两种细胞系的细胞内积聚差异。结果表明:HBA在两种细胞上的跨膜转运并无显著性差异,Papp（A-B）值在2.06-2.83×10-5cm/s范围之间。而GAS则呈现外排现象,净外排率为1.92、1.53和1.39。GAS的吸收透过系数值在1.63-1.83×10-7cm/s之间。GAS在MDCK-MDR1细胞内的吸收量比MDCK细胞内的小4倍左右。P-gp的抑制剂维拉帕米和CsA可以抑制GAS的外排作用。体外实验证明HBA不是P-gp的底物,它有很强的BBB透过能力。而GAS通过由P-gp介导的外排机制,使其CNS透过量受到很大的限制,难透过BBB,大脑摄取量非常低。2.3 Roch系列化合物的透过性研究为了评价五种Roch系列化合物在BBB中是否参与P-gp介导的外排,测定了它们在MDCK和MDCK-MDR1细胞上的透过情况。我们在两种细胞种板5天后进行转运实验。采用HPLC检测方法检测五种化合物在MDCK和MDCK-MDR1单细胞层上的透过量。测定在10、50、100μmol/L时几种化合物的P(（app）值,以及P-gp的两种抑制剂维拉帕米和CsA对10μmol/L Roch-2和100 mol/L Roch-5的抑制作用。结果显示:Roch-1、Roch-3和Roch-4在两种细胞上的跨膜转运并无显著性差异,净外排率都小于2,它们并不是P-gp的底物,Papp（A-B）值在0.37-2.63×10-5cm/s范围之间。Roch-2和Roch-5在MDCK-MDR1细胞上的外排率以及净外排率大于2。它们的Papp（A-B）值分别在0.55-1.06×10-5cm/s和0.89-1.33×10-6cm/s之间。维拉帕米和CsA可以抑制两个化合物的外排作用。实验证明,Roch-1、Roch-3和Roch-4有较强的BBB透过能力,而Roch-2和Roch-5是P-gp的底物,Roch-2透过BBB的能力中等,Roch-5难以透过BBB。