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背景和目的:骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤之一,极易发生肺转移。骨肉瘤在世界范围内的发病率约为2-3/百万/年,过去数十年中,骨肉瘤患者的五年生存率约维持在60%,然而对于发生肺转移或治愈后复发的患者,其五年生存率仅有25%,而传统治疗方案对于骨肉瘤患者的生存率没有明显提升。肿瘤的发生与免疫系统异常反应有关,但二者之间的相互作用尚不明确。现有研究表明,肿瘤的免疫逃逸是其发生和转移的关键原因,而骨肉瘤进行免疫逃逸的相关研究较为缺乏。免疫检查点作为免疫系统的重要组成部分,不仅是调控机体对自身免疫耐受的关键,也同样介导了对于肿瘤的免疫耐受和肿瘤的免疫逃逸。肿瘤细胞可以通过升高抑制性免疫检查点的表达,间接抑制免疫系统并发挥免疫逃逸作用。常见免疫检查点CTLA-4或PD-1/PD-L1被认为对免疫系统主要起抑制作用,其在肿瘤组织中异常的高表达也常与不良预后相关。这些免疫检查点的阻断剂,已用于多种肿瘤的治疗并取得了一定成效,但用于治疗骨肉瘤的效果不佳,因此有必要关注和研究新的免疫检查点以用于治疗。免疫检查点B7-H3在骨肉瘤等多种恶性肿瘤中异常高表达,且有研究表明其高表达能促进肿瘤细胞的增殖和转移,提示我们通过研究B7-H3对骨肉瘤发展的影响、分析B7-H3表达水平与骨肉瘤患者临床特征的相关性,或可帮助揭示B7-H3在骨肉瘤免疫逃逸中的作用。通过本次研究,我们期待发现更多影响骨肉瘤发展和患者预后的因素,以及骨肉瘤进行免疫逃逸可能的分子机制,为发展和完善骨肉瘤免疫治疗方案提供新的依据。方法:利用GEO数据库分析骨肉瘤组织中B7-H3等免疫检查点mRNA表达水平,通过免疫组织化学技术对104例临床标本进行染色并对B7-H3阳性率进行评分和分级。分析B7-H3表达水平与患者骨肉瘤分期、肺转移情况等临床特征的相关性,通过Kaplan-Meier生存分析评估B7-H3与患者生存期的相关性。通过慢病毒介导的基因过表达技术,构建过表达B7-H3的人和小鼠骨肉瘤细胞系。在体外环境下进行MTS/PMS实验、克隆形成实验,划痕实验、黏附实验,检测B7-H3对骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响。通过构建BALB/c小鼠皮下成瘤模型和尾静脉注射的肺转移模型,评估B7-H3在体内对骨肉瘤增殖和转移的影响。利用GEO数据库分析人骨肉瘤组织中B7-H3与CD4、CD8、FOXP3表达量的相关性,并通过免疫组织化学和免疫荧光技术对临床标本与小鼠骨肉瘤组织中浸润的淋巴细胞进行染色验证,分析B7-H3与肿瘤内浸润的淋巴细胞之间的相互作用。结果:GEO数据库分析显示,B7-H3在人骨肉瘤组织中的mRNA表达水平高于其他免疫检查点。免疫组织化学染色验证了 B7-H3在89.4%(93/104)的临床标本中表达,且肿瘤组织中的B7-H3表达量明显高于癌旁组织。相关性分析结果表明,B7-H3的高表达与骨肉瘤患者的更高的Enneking分期和肺转移相关。生存分析显示,B7-H3高表达的患者比B7-H3低表达的患者生存时间明显缩短且生存率更低。体外实验表明,B7-H3可以增强部分骨肉瘤细胞的增殖和克隆形成,对细胞的迁移和黏附能力没有明显的影响。动物实验表明,B7-H3在小鼠体内显著促进骨肉瘤发展。GEO数据库分析显示,在人骨肉瘤组织中,CD4表达量与B7-H3表达量呈明显正相关,而CD8、FOXP3表达量与B7-H3无明显相关性。免疫组织化学和免疫荧光实验证实,在人和小鼠骨肉瘤组织中,过表达的B7-H3可促进CD4+T细胞的浸润,对CD8+T细胞的浸润无明显影响。结论:骨肉瘤中异常高表达的B7-H3与患者的不良预后明显相关。B7-H3可促进骨肉瘤的发展,促进骨肉瘤组织中CD4+T细胞的浸润,而对CD8+T细胞的浸润无明显影响。本研究初步揭示了 B7-H3对骨肉瘤的影响及可能的分子机制,并希望为抗骨肉瘤免疫疗法的完善提供新的理论基础。