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脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)是当今社会数百万人死亡或残疾的主要原因之一。当大脑局部缺血时,血栓形成,大脑血流部分中断,造成缺血损伤。当血管再通,血液灌注时,会伴随着大量氧气,产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)分子,过量的ROS堆积,对机体造成二次损伤,凋亡相关信号通路被激活,导致细胞死亡或凋亡。星形胶质细胞(Astrocyte,AS)平铺在整个中枢神经系统,是脑组织中最丰富的一种神经胶质细胞,对于神经回路功能、突触形成、神经传递、代谢调节、血脑屏障的形成和维持以及中枢神经系统正常生物学功能的运行至关重要,参与执行生命活动中的多项功能并在任何地方都起着基本支持作用。脑缺血再灌注过程中,神经元最先遭受损伤,线粒体氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,OXPHOS)也受到不同程度的损伤,产生的能量不足以供神经元所需。此时,星形胶质细胞线粒体产生的三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)可以被神经元所摄取,从而减少神经元遭受脑缺血再灌注造成的损伤。人参皂苷 Rb1(20-S-protopanaxadiol aglycon,Rb1)和人参皂苷 Rg1(20-S-protopanaxatriol aglycon,Rg1)是人参皂苷含量最多的有效成分。研究发现人参皂苷对免疫系统疾病、癌症、心脑血管疾病、肿瘤、神经系统疾病等方面均有一定的治疗作用。本实验拟建立氧糖剥夺/再灌注(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)细胞模型模拟脑缺血再灌注损伤,以研究人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞的保护作用以及对线粒体功能的改善作用。目的本实验探讨人参皂苷Rb1和Rg1的神经保护作用以及其可能的作用机制。方法将出生1 d的ICR小鼠处死,原代培养小鼠大脑星形胶质细胞并传代,取第3代细胞用于实验。实验分组为Control组、OGD/R组、OGD/R+Rb1组、OGD/R+Rg1组,造模成功后,制备细胞样品并检测相关指标。1.人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞的影响(1)通过 GFAP(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞的纯度;(2)通过CCK-8实验检测细胞活力评价人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞活力的影响;(3)通过检测ROS水平和过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性评价人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞氧化应激水平的影响;2.人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞线粒体的保护作用机制研究(1)通过检测线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)拷贝数和线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)评价人参皂苷 Rb1 和 Rg1 对OGD/R损伤星形胶质细胞线粒体功能的影响;(2)通过检测线粒体呼吸链复合物Ⅰ-Ⅴ的活性和ATP水平评价人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞线粒体氧化磷酸化水平的调控作用。结果1.人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤的星形胶质细胞有一定的保护作用(1)激光共聚焦显微镜观察星形胶质细胞GFAP免疫荧光染色,显示原代培养星形胶质细胞纯度较高,细胞胞浆丰富,有许多长而突起的分支,细胞状态良好。(2)与Control组相比,星形胶质细胞经OGD/R损伤后,细胞活力明显下降(P<0.01),细胞出现圆缩或脱壁现象,且折光性减弱。与OGD/R组相比,给予人参皂苷Rb1(2、5、10 μmol/L)和Rg1(2、5、10 μmol/L)干预后,星形胶质细胞活力有明显上升趋势,其中5 μmol/L人参皂苷Rb1和10 μmol/L人参皂苷Rg1效果较明显(P<0.01),细胞折光性增强,突起变长,明显改善细胞状态。2.人参皂苷Rb1和Rg1通过抗氧化应激减少OGD/R对星形胶质细胞的损伤与Control组相比,星形胶质细胞经OGD/R损伤后,随着复氧时间的增加,星形胶质细胞ROS的产生也逐渐增加(P<0.01),CAT活性逐渐下降(P<0.01),经人参皂苷Rb1(5 μmol/L)和Rg1(10 μmol/L)干预后,可见星形胶质细胞ROS水平明显下降(P<0.01),CAT活性上升(P<0.05),表明人参皂苷Rb1和Rg1可通过抗氧化应激减少OGD/R对星形胶质细胞的损伤。3.人参皂苷Rb1和Rg1通过调节线粒体氧化磷酸化水平改善OGD/R损伤星形胶质细胞的线粒体功能(1)与Control组相比,OGD/R损伤星形胶质细胞后,随着复氧时间的增加,星形胶质细胞MMP持续去极化(P<0.01),mtDNA拷贝数明显下降(P<0.01),与 OGD/R 组相比,人参皂苷 Rb1(5 μmol/L)和 Rg1(10μmol/L)可以增加mtDNA的拷贝数(P<0.05),同时抑制MMP去极化(P<0.01),表明人参皂苷Rb1和Rg1可以改善OGD/R损伤的星形胶质细胞线粒体功能。(2)与Control组相比,星形胶质细胞经OGD/R损伤后,随着复氧时间的增加,线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ活性和ATP水平明显下降(P<0.05),人参皂苷Rb1(5 μmol/L)和Rg1(10μmol/L)干预后,星形胶质细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ活性和ATP水平有明显的上升趋势(P<0.05),表明人参皂苷Rb1和Rg1可以通过调节氧化磷酸化水平减少OGD/R对星形胶质细胞线粒体的损伤。结论综上所述,随着复氧时间的增加,OGD/R会加剧星形胶质细胞的损伤。人参皂苷Rb1和Rg1可以通过调节线粒体氧化磷酸化水平,增加ATP的产生,抗氧化应激,改善线粒体功能,减少OGD/R对星形胶质细胞造成的损伤,具有一定的神经保护作用。