研究背景和意义中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤后的修复与再生,一直是医学研究领域的热点和难点。视神经(optic nerve,ON)是CNS的一部分,眼外伤、青光眼等疾病均可导致视神经损伤,但目前仍缺乏治疗的有效手段,常引起患者视功能障碍甚至失明。微环境中大量存在的抑制性髓鞘磷脂相关因子(Myelin-associated inhibitor,MAI),是视神经损伤后再生困难的主要原因之一。视神经髓鞘通常包绕视神经轴突,当视神经损伤后暴露在大量MAI的环境中,MAI特异性地与视神经轴突上的受体结合,导致生长锥板状伪足和丝状伪足细胞骨架不稳定,从而阻碍视神经再生。在众多MAI中,少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)、勿动蛋白(Nogo-A)和髓磷脂相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG),对神经元轴突再生发挥主要的抑制作用。在CNS中这三个MAI有两个已知的共同受体,即抑制分子受体(nogo-66 receptor,Ng R)和配对免疫球蛋白样受体B(paired immunoglobulin-like receptor B,PirB)。但有研究发现,NgR在CNS再生中的髓磷脂相关抑制作用十分有限,单一的NgR基因敲除并不能显著降低MAI对神经元轴突生长的抑制作用,而单一的PirB拮抗却可以减少这种抑制。我们推测,在中枢神经系统中,PirB可能在抑制轴突生长上占据主导地位。然而这方面的研究特别是PirB在视神经损伤后有何变化尚不清楚,其作用机制也不明确。本研究在观察到视神经损伤后视网膜中PirB表达发生变化的基础上,通过利用干扰病毒抑制PirB表达等手段,探讨其保护视网膜神经节细胞(Retinal Ganglion Cells,RGCs)、促进轴突生长及视神经损伤后视功能恢复的作用和机制。本研究的结果可以为视神经损伤修复的临床治疗提供新的靶点和方法。研究目标:通过体内、体外实验,模拟视神经损伤模型,明确PirB在视神经损伤修复再生中的作用及可能机制。研究方法:1.制作SD大鼠视神经钳夹损伤模型,免疫荧光染色观察伤后1、3、7d视网膜上PirB的表达情况,利用q RT-PCR和Western blotting方法检测钳夹伤后1,3,7,14d视网膜中PirB的m RNA和蛋白水平。2.体外培养原代RGC细胞,分别用MAG、Nogo-A、OMgp抑制其轴突生长,再用AD shRNA PirB干扰RGC的PirB表达,用免疫荧光染色法检测RGC细胞轴突的长度。3.体外培养原代Müller细胞,用AD shRNA PirB干扰其PirB表达,利用免疫荧光染色、q RT-PCR和Western blotting方法验证病毒对Müller细胞中PirB的干扰效率;再用Western blotting方法检测Müller细胞干扰了PirB后P-JAK、P-Stat3、P-SHP1、SHP1、SHP2、P-SHP2以及NGF、CNTF、BDNF等神经生长因子的表达变化;接着将Müller细胞与损伤的RGC共培养,用免疫荧光的方法检测RGC轴突再生的情况;最后用si RNA CNTF干扰Müller细胞的CNTF表达,通过免疫荧光染色检测共培养的RGC轴突再生情况。4.在动物实验来进一步验证PirB在体外细胞实验中的作用。将AAV shRNNA PirB注射到SD大鼠玻璃体腔中21d,Western blotting方法检测PirB的干扰效率;用干扰了视网膜PirB表达的大鼠制备视神经钳夹伤模型,分别于伤后7、14、28d行视网膜铺片,计数CTB阳性标记的RGC数目;免疫荧光染色观察大鼠视神经钳夹伤后7、14、28d视神经中GAP43的表达;用视觉电生理FVEP检测视神经钳夹伤后28d后的N2、N1-P1、N2-P2等视功能指标。研究结果1.正常情况下PirB主要在视网膜RGC中表达,视神经钳夹伤后视网膜的PirB荧光从GCL层向ONL层激活,RGC和Müller细胞的PirB明显激活;RGC和Müller细胞的PirB激活具有时间依赖性,荧光表达随着钳夹伤时间的延长而逐渐增强。钳夹伤后视网膜组织PirB的mRNA和蛋白水平都较Blank、Sham组显著升高。2.AD shRNA PirB可以有效敲低体外培养的RGC细胞的PirB表达,但对MAG、Nogo-A、OMgp这三种MAI抑制的轴突的生长都没有明显的促进作用。3.体外培养的Müller细胞表达PirB,用AD shRNA PirB敲低其PirB的表达后,可以促进Müller细胞中P-SHP1、P-Stat3、CNTF的蛋白表达;敲低PirB表达的Müller细胞与RGC细胞共培养,可以明显促进RGC轴突损伤后再生,并且这种促再生作用可以被si RNA CNTF逆转。4.敲低SD鼠视网膜PirB的表达,可以促进钳夹伤后视神经轴突GAP43荧光表达;但对视网膜RGC细胞的存活没有明显的保护作用,AAV shRNA PirB组和AAV shRNA对照组在视神经钳夹伤后7,14,28d的视网膜RGC计数,差异没有统计学意义;敲低SD鼠视网膜PirB的表达,对钳夹伤后28d的FVEP的N2,N1-P1,N2-P2值未见明显改善。研究结论1.视神经损伤后视网膜RGC和Müller细胞的PirB表达升高,提示PirB在视神经损伤后的病理变化中扮演了重要的角色。2.Müller细胞中的PirB在MAI抑制轴突生长的作用中可能比RGC细胞中的PirB更重要。其机制可能与通过PirB-SHP1-JAK/Stat3-CNTF途径调节CNTF的表达有关。3.抑制视网膜的PirB表达,可以显著促进视神经钳夹伤后的轴突再生,但不具有RGC保护效应,且在本研究中未显现出对视功能恢复有显著的改善,提示只促进视神经再生而不保护RGC的存活导致PirB治疗作用有限。