随着环境污染日益加重,由其带来的对人体健康危害越来越受到关注,尤其是环境污染造成儿童视力发育的异常和弱视等一些眼病,成为了近年来研究热点。研究表明,从胚胎期到6岁是儿童视网膜发育和视觉功能形成的关键时期,环境污染可能对这一时期视觉系统的正常发育产生不良影响,导致视觉发育异常、色盲和视力丧失等。多氯联苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs)作为一类常见的全球环境有机污染物,其理化性质极为稳定,能够长期存在于我们的环境当中并且极难降解。由于多氯联苯具有极强的脂溶性,因此非常容易被人体皮肤吸收并且积蓄在人体内。如果儿童长期暴露于多氯联苯超标的环境中将会对视网膜发育产生严重的不利后果。本课题组的前期研究结果表明,多氯联苯暴露会造成斑马鱼视网膜细胞的数量减少和排列紊乱,证实其会造成视网膜的异常发育。同时通过斑马鱼幼鱼视动反应研究,发现斑马鱼幼鱼在多氯联苯暴露后出现反向游动和犹豫不前比例增加,以及视网膜相关的特异表达基因下降,证实了多氯联苯暴露会造成斑马鱼视力下降,影响视觉功能发育。然而,需进一步研究来阐明环境污染造成视网膜发育异常的机理,为做好相应的防治工作提供新的思路和理论依据。近年来,随着分子生物学的发展及生物测序技术的日渐成熟,多肽组学成为了一个热门话题。多肽组学的研究的重要方法主要是酶法多肽,即用生物降解法来获得内源性多肽进行进一步功能研究。已经有一些文献报道了内源性多肽可以参与视网膜的发育、修复等过程。故本研究以内源性多肽为切入点,先通过多肽液相质谱检测技术(liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS),研究多氯联苯暴露对斑马鱼内源性多肽表达谱的影响,进一步对差异表达多肽的理化特性和生物学信息分析,寻找暴露后差异表达的内源性多肽中与视网膜发育密切相关的多肽,选择同源性好、组织特异性强的内源性多肽“CKASKGKL”在视网膜发育中的作用和功能做了初步研究,发现其能够促进视网膜神经节细胞的增殖,并通过全转录组测序技术,进一步寻找到了其作用的靶基因并进行了验证,这项研究结果为今后深入研究环境污染对视网膜发育的影响以及采取相关的防治措施提供新的思路。第一部分多氯联苯暴露后斑马鱼内源性多肽质谱分析及视网膜发育相关多肽筛选目的:探讨多氯联苯暴露后斑马鱼胚胎内源性多肽的表达变化并筛选与视网膜发育密切相关的内源性多肽。方法:(1)以斑马鱼为模式动物,通过已建立的斑马鱼多氯联苯暴露模型,收集48小时斑马鱼胚胎,同时设置对照组,采用LC-MS/MS联合串联质谱标记法(TMT)检测两组之间内源性多肽的表达情况,筛选出表达差异的内源性多肽;(2)分析差异表达的内源性多肽的理化性质、酶切位点、前体蛋白,采用IPA分析、GO分析等生物信息学分析方法筛选出与视网膜发育相关的内源性多肽。结果:(1)通过质谱检测总共筛选了7900条内源性多肽,进一步分析发现其中具有差异表达的有90条(P<0.05,差异倍数>2倍),其中29条在多氯联苯暴露后表达上调,61条在多氯联苯暴露后被下调。理化特性分析发现分子量多分子在3000Da以下,等电点主要以弱酸和弱碱性为主,无中性。(2)通过基因本体论(Gene Ontology,GO)分析,发现差异多肽主要涉及到生物体的细胞发育过程,跟细胞膜密切相关,主要的分子功能是结合。信号通路分析(Ingenuity Pathway Analysis,IPA)分析发现,差异多肽富集信号通路包括神经元介导的轴突导通路、Slit/Robo介导的轴突导通路、Wnt信号通路,这些信号通路都与视网膜发育密切相关。通过研究差异多肽互相之间的调控关系以及与视网膜发育的关系,最终挑选出与视网膜发育相关的多肽。结论:多氯联苯暴露影响了斑马鱼内源性多肽的表达,部分差异表达的内源性多肽可能参与了多氯联苯暴露导致的视网膜发育异常。第二部分视网膜内源性多肽“CKASKGKL”在视网膜发育中的作用及其机制研究目的:探究差异表达的内源性多肽“CKASKGKL”的在视网膜发育中作用及机制。方法:(1)以斑马鱼为模式动物,通过HE染色验证内源性多肽对斑马鱼视网膜发育的影响;(2)以视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cell,RGC)为工具细胞,探讨内源性多肽对细胞的增殖、迁移、凋亡及周期的影响;(3)通过测序技术筛选多肽“CKASKGKL”下游靶基因,并对靶基因进行验证,探索其在视网膜发育中的作用机制。结果:(1)注射内源性多肽后,斑马鱼视网膜神经节细胞增多,促进视网膜神经节细胞的增殖、迁移,对细胞凋亡无影响,能促进多肽前体蛋白Ntn-1以及细胞特异基因Brn-3的表达。(2)通过全转录组测序技术(RNA-seq),共筛选得到下游靶基因(差异倍数大于2倍P<0.05)207个,其中注射后表达下调基因69个,注射后表达上调基因138个,进一步生物信息学分析发现与神经发育和视网膜发育相关的有24个。通过实时定量荧光PCR验证发现Bcl-6、Apaf1、Scrt2和Srcc5共4个基因重复实验结果稳定,而Bcl-6的功能结果与目前结果一致,多肽可能通过减低Bcl-6的表达促进细胞增殖。结论:多肽“CKASKGKL”能促进视网膜神经节细胞的增殖和迁移,促进细胞前体蛋白以及细胞特异基因的表达,Bcl-6可能是其调控的靶基因。