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竹笋是一种优质的膳食纤维原料,可作为功能性添加剂应用于食品领域。含竹笋膳食纤维的食品有降血糖血脂、预防便秘和控制体重等功效。竹笋膳食纤维的组成、化学结构和理化性质决定其功能特性,因此为了制备高质量的竹笋膳食纤维,提高膳食纤维的理化特性和功效,需采用合适的方式处理膳食纤维。酶处理技术是一种绿色有效方法,利用该方法处理膳食纤维,能改善其网络结构,形成可溶性成分及小分子物质。长足大竹象Cyrtotrachelus buqueti作为一种竹笋专食性害虫,具有高效降解竹笋木质纤维素的能力。进一步研究表明,其基因组中含有多个葡萄糖脱氢酶编码基因。因此,为了改善竹笋膳食纤维理化性质,丰富昆虫来源的葡萄糖脱氢酶资源,本文运用生物信息学手段从长足大竹象基因组数据中筛选及分析得到了一个葡萄糖脱氢酶基因并命名为CbGDH,体外克隆、转化毕赤酵母异源表达,获得了具有生物活性的酶,并研究了该重组酶的酶学性质,探究了其对竹笋膳食纤维理化性质的影响,主要结果如下:1、生物信息学分析表明,CbGDH包含长度为1404bp完整开放式阅读框,并编码467个氨基酸。碱基T、C、A和G含量分别为26.4%、21.7%、32.3%、19.6%。起始和终止密码子分为ATG、TAA。预测蛋白质的分子量为51.77 kDa,等电点为6.03。该序列无跨膜区、无信号肽。氨基酸同源序列比对发现,该序列与米象Sitophilus oryzae葡萄糖脱氢酶同源性高达74.52%,其次是光肩星天牛Anoplophora glabripennis葡萄糖脱氢酶同源性达53.98%。选取与该基因同源性较高的17个氨基酸序列构建了NJ系统发育树。结果发现该氨基酸序列与米象、山松大小蠹Dendroctonus ponderosae以及光肩星天牛三个鞘翅目昆虫聚在一簇,且与NCBI Blast同源比对结果相符。2、提取长足大竹象肌肉的总RNA再反转录出cNDA,克隆出CbGDH基因并且成功在毕赤酵母中诱导表达。表达产物在浓缩后进行SDS-PAGE凝胶电泳,在51.77 kDa处有明显目的蛋白条带,以及经过酶活测定发现存在酶活性,表明CbGDH基因在毕赤酵母中成功得到了表达。3、酶学性质的研究结果表明,最适条件为pH 7.0,温度50℃;在5~7的pH范围内稳定性最好,保温1h后残余酶活在各自pH值的缓冲溶液中仍能达到原酶活的70%以上;酶在最适温度下保温1h后,仍能保持80%以上酶活力;在最适pH和温度下,酶比活达4.32U/mg。4、与仅用复合酶(纤维素酶,木聚糖酶,漆酶)处理竹笋膳食纤维相比,用复合酶+10 mL葡萄脱氢酶CbGDH处理后的膳食纤维其持水力增加了10.39%,持油力增加了5.57%,膨胀力增加了13.29%,说明葡萄脱氢酶CbGDH可能与复合酶协同提高了膳食纤维的理化性质。总之,本文克隆、表达了来源于长足大竹象的葡萄糖脱氢酶基因,研究了酶学性质,探究了葡萄糖脱氢酶CbGDH协同其它酶对竹笋膳食纤维理化性质的影响。本文一方面丰富了葡萄糖脱氢酶的资源,为今后深入开展葡萄糖脱氢酶的功能研究及商业化生产提供了支持,另一方面为长足大竹象木质纤维素降解酶的应用提供了借鉴。