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第一部分:BMSCs在内毒素导致的小鼠急性肝损伤中的保护作用目的:观察静脉给予外源性BMSCs能否抑制内毒素(LPS)诱导的小鼠急性肝损伤以及肝脏KCs中的NLRP3炎症小体活化及血清中的炎症介质表达水平,阐明BMSCs在脓毒症导致的急性肝损伤中的意义及潜在机制。方法:全骨髓细胞选择性贴壁法从Balb/C小鼠胫骨、股骨中分离BMSCs,采用慢病毒转染ptges及ptges sh RNA至BMSCs,建立稳定的ptges过表达BMSCs细胞株(BMSCs-PGE2(+))及ptges沉默的BMSCs细胞株(BMSCs-PGE2(-));30只Balb/C小鼠随机分为5组:(1)对照组,(2)LPS组,(3)LPS+BMSCs组,(4)LPS+BMSCs-PGE2(+)组,(5)LPS+BMSCs-PGE2(-)。对照组小鼠腹膜腔及尾静脉均注射PBS,另外四组小鼠先予以腹膜腔注射LPS(10 mg/kg)处理12小时,然后分别尾静脉注射PBS、BMSCs、BMSCs-PGE2(+)及BMSCs-PGE2(-)(1×106个)处理12小时;获取小鼠肝脏,采用HE染色评估肝脏炎症程度,以TUNEL染色评估肝脏细胞凋亡情况;分离肝脏KCs,通过Western blotting检测KCs中NLRP3,ASC,Pro-Casp1,Caspase-1及Pro-IL-1β蛋白表达水平;荧光实时定量PCR检测KCs中NLRP3,ASC,Pro-Casp1及Caspase-1 m RNA表达水平;收集小鼠血液,ELISA法测定血清中ALT、AST、IL-1β、IL-10及PGE2水平。结果:(1)LPS组肝细胞明显水肿,肝脏内大量炎细胞浸润;LPS+BMSCs组肝细胞水肿减轻,炎细胞浸润减少,LPS+BMSCs-PGE2(+)处理组,肝脏炎症程度进一步减轻,而LPS+BMSCs-PGE2(-)组较LPS组无明显变化。肝脏炎细胞浸润数量于LPS组最多,LPS+BMSCs组明显下降,LPS+BMSCs-PGE2(+)处理后炎细胞数量进一步减少,差异具有统计学意义(P<0.05);而LPS+BMSCs-PGE2(-)组较LPS组无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)LPS组中TUNEL染色阳性表现的肝脏凋亡细胞较对照组明显增加,LPS+BMSCs组肝脏凋亡细胞较LPS组明显减少(P<0.05),LPS+BMSC-PGE2(+)组肝脏内仅见零星分布的凋亡细胞(P<0.05),差异具有统计学意义;而LPS+BMSC-PGE2(-)组,肝脏内凋亡细胞较LPS组无明显变化,差异不具有统计学意义(P>0.05)。(3)KCs中NLRP3,ASC及caspase-1 m RNA相对表达量在LPS组最高,LPS+BMSC组较LPS组明显下降,LPS+BMSC-PGE2(+)组较LPS+BMSC组进一步下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与LPS组比较,LPS+BMSC-PGE2(-)组无明显下降,差别不具有统计学意义(P>0.05)。(4)KCs中NLRP3,ASC,Pro-Casp1,Caspase-1及Pro-IL-1β蛋白表达量在LPS组最高,LPS+BMSC组较LPS组明显减低,LPS+BMSC-PGE2(+)组较LPS+BMSC组进一步下降,差异具有统计学意义;而LPS+BMSC-PGE2(-)组较LPS组无明显变化(P>0.05)。(5)血清PGE2水平在对照组最低,LPS组略有升高;LPS+BMSC组较LPS组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);LPS+BMSC-PGE2(+)组最高,明显高于LPS+BMSCs组,差异具有统计学意义(P<0.05);而在LPS+BMSC-PGE2(-)组与LPS组及空白对照组无明显差异(P>0.05)。(6)血清ALT,AST及IL-1β浓度在LPS组明显最高;LPS+BMSC组较LPS组明显降低,LPS+BMSC-PGE2(+)组较LPS+BMSC组进一步下降,差异均具有统计学意义(P<0.05);而LPS+BMSC-PGE2(-)组较LPS组无明显下降,差异无统计学意义(P>0.05)。血清IL-10浓度在LPS组较空白对照组轻度上升;LPS+BMSC组明显高于LPS组;LPA+BMSC-PGE2(+)组较BMSCs处理组进一步升高,差异具有统计学意义(P<0.05);而在LPS+BMSC-PGE2(-)组,IL-10水平较LPS组无明显变化(P>0.05)。结论:尾静脉注射BMSCs可以减轻腹膜腔注射LPS诱导的小鼠急性肝损伤,并可抑制LPS诱导的小鼠肝脏KCs中NLRP3炎症小体的表达;过表达ptges增加了BMSCs分泌PGE2的能力,并加强了BMSCs的肝脏保护作用及对肝脏KCs中NLRP3炎症小体的抑制。第二部分:观察BMSCs对Kupffer细胞中NLRP3炎症小体活化的影响目的:进一步证实BMSCs可以直接抑制的KCs中NLRP3炎症小体的活化,观察BMSCs是否通过分泌PGE2达到抑制KCs中NLRP3炎症小体的活化。方法:KCs以2×106/皿接种在Transwell上室中,随机分为5组,对照组,LPS处理组,LPS+BMSC组,LPS+BMSC-PGE2(+)组及LPS+BMSC-PGE2(-)组,共培养三组中将BMSC/BMSC-PGE2(+)/BMSC-PGE2(-)以1×106/皿种于Transwell下室。根据分组将KCs与BMSC/BMSC-PGE2(+)/BMSC-PGE2(-)置入Tranwell共培养体系,LPS组及共培养体系组予以终浓度为10 ng/ml LPS的无血清培养基共培养5 h,然后以终浓度为5m M的ATP的无血清培养基共培养1h。以Western blotting检测KCs中NLRP3,ASC,Pro-Casp1,Caspase-1及Pro-IL-1β蛋白表达水平,RT-q PCR检测KCs中NLRP3,ASC及Caspase-1 m RNA表达水平,ELISA检测培养上清中PGE2、IL-1β、IL-18、IL-10及TNF-α。结果:(1)NLRP3,ASC及caspase-1 m RNA相对表达量在LPS组中较对照组明显上升(P<0.05);与LPS组相比较,LPS+BMSC组明显下降,并在LPS+BMSC-PGE2(+)组进一步下降;然而与LPS组比较,LPS+BMSC-PGE2(-)组中NLRP3,ASC及caspase-1 m RNA相对表达量并未明显下降(P>0.05)。(2)NLRP3,ASC,Pro-Casp1,Caspase-1及Pro-IL-1β蛋白表达量在LPS组中较空白对照组明显升高(P<0.05);与LPS组相比较,在LPS+BMSC组中的表达明显减低,且在LPS+BMSC-PGE2(+)组进一步下降(P<0.05);而LPS+BMSC-PGE2(-)组较LPS组无明显变化(P>0.05)。(3)培养上清液中PGE2水平LPS组较空白对照组略有上升;LPS+BMSC组较LPS组明显升高(P<0.05);LPS+BMSC-PGE2(+)组最高,明显高于LPS+BMSCs组(P<0.05);而在LPS+BMSC-PGE2(-)组显著低于LPS+BMSC-PGE2(+)组(P<0.05),且与LPS组及空白对照组无明显差异(P>0.05)。(4)培养上清液IL-1β,IL-18及TNF-α浓度在LPS组最高;在LPS+BMSCs组较LPS组明显降低,在LPS+BMSC-PGE2(+)组进一步下降(P<0.05);而LPS+BMSC-PGE2(-)组较LPS组无明显下降(P>0.05)。培养上清液中IL-10水平在LPS组较空白对照组轻度升高,在给予BMSCs处理后,IL-10明显增加,给予BMSC-PGE2(+)处理后,IL-10水平进一步升高(P<0.05);而在LPS+BMSC-PGE2(-)组,IL-10水平较LPS组无明显变化(P>0.05)。结论:共培养实验进一步证实BMSCs拥有抑制LPS+ATP诱导的KCs中NLRP3炎症小体活化的作用;过表达PGE2加强了BMSCs对NLRP3炎症小体的抑制作用,沉默PGE2抑制了BMSCs对NLRP3炎症小体的抑制作用。第三部分:PGE2抑制Kupffer细胞中NLRP3炎症小体活化的分子机制目的:为探索PGE2是直接抑制了KCs中NLRP3炎症小体,还是通过促使KCs增加IL-10的分泌而间接抑制了NLRP3炎症小体的活化。方法:KCs随机分为4组:Group A为对照组;Group B予以LPS(10ng/ml)处理5小时,然后在予以ATP(5m M)处理1小时;Group C在Group B组处理因素基础上,于最后30分钟加入PGE2(终浓度为0.1m M);Group D在C组处理因素基础上,于PGE2加入前30分钟加入FR180204)。Western blotting检测KCs中NLRP3,ASC,Caspase-1及p-ERK1蛋白表达水平。RT-q PCR检测KCs中NLRP3,ASC及Caspase-1 m RNA。ELISA检测培养上清中IL-1β,IL-18,TNF-α及IL-10水平。结果:(1)在B组中给予LPS+ATP处理后,NLRP3,ASC及Caspase-1蛋白表达水平较A组明显升高(P<0.05);p-ERK1蛋白表达水平较A组无明显变化;C组NLRP3,ASC及Caspase-1蛋白表达水平较B组明显降低,p-ERK1蛋白表达水平较及B组明显增高;D组,NLRP3,ASC及Caspase-1蛋白表达水平较C组升高(P<0.05),但仍略低于B组(P>0.05);p-ERK1蛋白表达水平较C组显著降低,(P<0.05),与B组差异不明显(P>0.05)。(2)NLRP3,ASC及caspase-1m RNA相对表达量与蛋白表达趋势基本一致。(3)培养上清液中IL-1β,IL-18及TNF-α浓度在LPS+ATP处理的B组中明显最高,显著高于A组及C组(P<0.05);C组中给予PGE2处理后以上促炎因子较B组明显降低(P<0.05);D组中给予FR180204处理后IL-1β,IL-18及TNF-α水平明显升高,与B组相当(P>0.05),显著高于C组(P<0.05)。(4)培养上清液中IL-10 LPS+ATP处理的B组较A组略有升高,C组中给予PGE2处理后IL-10较B组明显升高(P<0.05);D组中给予FR180204处理后IL-10水平显著底于C组(P<0.05),恢复至B组水平(P>0.05)。结论:KCs中ERK1信号通路介导的IL-10分泌可能是PGE2抑制NLRP3炎症小体活化的关键点。