肺癌相关成纤维细胞的分离、鉴定及促肺癌细胞增殖的研究

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xpzcz1990
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[目 的]恶性肿瘤的发病率在全球范围内呈增长趋势,肺癌是其中的头号杀手。分子调节免疫应答、重塑肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是肺癌治疗研究的热点。TME是肿瘤在发生、发展过程中所处的内环境,肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma associated fibroblast,CAF)是TME重要的组成部分,成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein,FAP)既是CAF的重要分子标志物,又是肿瘤进展过程中重要因素。阐明FAP、CAF和TME三者的关系及分子机制,有利于阐明肿瘤微环境在肿瘤的发生和进展过程中的作用,为分子免疫调节治疗肺癌提供理论依据。[方法]1、分离人肺癌肿瘤组织CAF1、CAF2,蛋白质印记和免疫荧光检测FAP、α-SMA、Vimentin、FSP1的表达。以人正常组织来源的原代成纤维细胞NF作为对照,CCK8法检测肺癌CAF的增殖,ELISA法检测CAF中IL-6的分泌。2、构建Luciferase标记的肺腺癌细胞SPC-A-1和非小细胞肺癌细胞A549肺癌细胞。分别将 CAF1、CAF2 与 Luciferase 标记 SPC-A-1、A549 以 4:1、2:1、1:1、1:2、1:4比例体外共培养,以SPC-A-1组、NF+SPC-A-1组作为对照,检测24h、48h、72h的生物荧光素强度。3、Luciferase 标记 SPC-A-1,实验组裸鼠皮下注射 CAF2+SPC-A-1+Metrigel,对照组皮下注射NF+SPC-A-1+Metrigel、SPC-A-1+Metrigel。物理测量裸鼠肿瘤体积,小动物活体荧光成像观察裸鼠体内肿瘤细胞增殖情况。第28天处死裸鼠,测量肿瘤体积和重量,HE染色。4、建立FAP过表达成纤维细胞系(FAP-BJ、FAP-HFF)、FAP过表达肺腺癌细胞系(FAP-SPC-A-1)及阴性对照细胞系(NC-BJ、NC-HFF、NC-SPC-A-1)。WB检测FAP蛋白的表达;实时定量PCR检测FAP、IL-6ST mRNA水平;CCK8法检测增殖;ELISA法检测IL-6的分泌。5、将 FAP-BJ 与 Luciferase 标记的 SPC-A-1、A549 以 4:1、2:1、1:1、1:2、1:4比例混合体外共培养,以SPC-A-1组、NC-BJ+SPC-A-1组作为对照,检测24h、48h、72h的生物荧光素强度。6、体外共培养实验模拟体内肿瘤微环境,研究FAP对TME中IL-6水平的影响。共培养体系分别为FAP-BJ+SPC-A-1、FAP-HFF+PBMC、FAP-SPC-A-1+PBMC、FAP-HFF+SPC-A-1+PBMC,收集培养上清检测 IL-6 浓度。[结 果]1、CAF的鉴定经 WB 检测,Vimentin 的表达 NF>CAF1>CAF2;FSP1 的表达CAF1>CAF2>NF;α-SMA 的表达 CAF2>CAF1>NF;FAP 在 CAF1、CAF2 中表达量较低。免疫荧光结果显示Vimentin在CAF1、CAF2、NF均有表达;α-SMA在CAF1、CAF2中有表达,但在NF中表达不明显。增殖能力显示CAF2>CAF1>NF,差异有统计学意义。IL-6 的水平 CAF2>CAF1>NF(P<0.0001)。2、体外CAF2促肺癌细胞增殖情况生物荧光素强度 CAF2+SPC-A-1 组>NF+SPC-A-1 组、SPC-A-1 组(P<0.05)。生物荧光素强度CAF2+A549组与NF+A549组之间无显著差异,但均弱于A549组,成纤维细胞比例越大,差异越明显。3、体内CAF2促肿瘤增殖情况Day28 物理测量肿瘤体积,CAF2+SPC-A-1 组>NF+SPC-A-1 组(P<0.05);CAF2+SPC-A-1组与SPC-A-1组无统计学差异。Day28检测活体荧光成像信号,CAF2+SPC-A-1 组>NF+SPC-A-1 组(P<0.05);CAF+SPC-A-1 组与 SPC-A-1 组无统计学差异。处死裸鼠,物理测量肿瘤体积,CAF+SPC-A-1组、SPC-A-1组>NF+SPC-A-1组(P<0.05);各组肿瘤重量无统计学差异(P>0.05)。4、FAP过表达细胞系的鉴定WB 检测 FAP 蛋白表达水平:FAP-BJ>NC-BJ,FAP-HFF>NC-HFF,FAP-SPC-A-1>NC-SPC-A-1。PCR 检测 FAP mRNA 水平:FAP-HFF>NC-HFF(P<0.0001),FAP-SPC-A-1>NC-SPC-A-1(P<0.0001)。检测 IL-6ST mRNA 水平:FAP-HFF>NC-HFF(P<0.01),FAP-SPC-A-1>NC-SPC-A-1(P<0.05)。CCK8检测细胞增殖能力:FAP-BJ>NC-BJ(P<0.01)。ELISA检测分泌IL-6水平:FAP-BJ>NC-BJ(P<0.0001)。5、FAP过表达成纤维细胞与肺癌细胞体外共培养实验结果生物荧光素强度 FAP-BJ+SPC-A-1 组>NC-BJ+SPC-A-1 组、SPC-A-1 组,(P<0.05)。FAP-BJ+A549 组、NC-BJ+A549 组<A549 组(P<0.05),成纤维细胞比例越大,差异越大。IL-6 水平检测:FAP-BJ+SPC-A-1>NC-BJ+SPC-A-1,FA P-HFF+PBMC>NC-HFF+PBMC,FAP-SPC-A-1+PBMC>NC-SPC-A-1+PBMC,FAP-HFF+SPC-A-1+PBMC>NC-HFF+SPC-A-1+PBMC,差异有统计学意义。[结 论]1、分离并鉴定了两株肺癌相关成纤维细胞株CAF1和CAF2,检测发现CAF2的增殖能力和分泌IL-6的水平均强于CAF1和NF。体外CAF2能促进SPC-A-1细胞增殖,但抑制A549细胞增殖。2、构建的FAP过表达成纤维细胞系FAP-BJ的增殖能力和分泌IL-6的水平均强于对照组,体外促进SPC-A-1细胞增殖,但抑制A549细胞增殖。3、FAP通过增强共培养体系中IL-6的表达促进SPC-A-1的增殖。
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