背景:肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率逐年升高,然而目前仍然缺乏有效的防治手段。蛋白酪氨酸激酶已经被证明在肺癌的发病中扮演着重要角色,酪氨酸激酶抑制剂也在肺癌的治疗中取得了肯定的疗效。NOK是一种新的蛋白酪氨酸激酶,目前的研究发现其在急性白血病、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中表达,可能是一种新的候选癌基因。然而,NOK在肺癌发病中的作用尚缺乏充分的临床证据支持,其通过何种机制参与肺癌发病、受何种信号通路调节也不甚清楚。为此,本实验从临床研究,细胞功能学实验及机制研究三个方面探索NOK在肺癌发病中的作用及机制,以期为肺癌的发病机制和靶向治疗研究提供新的思路。方法:1.随机入组2007年至2010年在第四军医大学唐都医院胸腔外科行手术治疗的非小细胞肺癌患者191例并进行随访,有以下条件之一者予以排除:接受术前化疗者;接受术前放疗者;接受TKIs等靶向药物治疗者。病人信息的采集包含以下要素:年龄、性别、吸烟史、临床症状、手术方式、肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移情况、术后病理结果。收集上述患者术中切除的肿瘤组织标本并进行免疫组织化学染色,ROC检验确立阳性标准,χ2-test法分析NOK蛋白表达与各临床要素的相关性,Kaplan-Meier法绘制生存曲线,log-rank test法分析NOK蛋白表达与患者生存时间之间的关系;Cox风险比例模型法分析生存时间和临床要素之间的单因素和多因素相关性。2.利用电穿孔法在肺癌A549细胞中转染NOK全长质粒,设计干涉NOK基因表达的RNAi片段并用慢病毒包装后感染肺癌H520细胞,分别构建稳定过/低表达NOK基因的肺癌细胞系。细胞划痕实验及Transwell小室迁移实验分析NOK过/低表达后对肺癌细胞迁移能力的影响。Transwell小室侵袭实验分析NOK过/低表达后对肺癌细胞侵袭能力的影响。3.运用q RT-PCR实验检测NOK过/低表达后对肺癌细胞中EMT标志物E-cadherin、Vimentin基因表达的影响;运用Western Blot实验检测NOK过/低表达后对肺癌细胞中EMT标志物E-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响4.运用10-9M的雌二醇刺激肺癌H520和Calu-1细胞,用q RT-PCR方法分别检测在雌二醇刺激0h/2h/12h/24h后肺癌细胞中NOK基因的表达情况;运用Western Blot实验检测在雌二醇刺激0h/12h后肺癌细胞中NOK蛋白的表达情况。利用生物信息学分析NOK启动子区,寻找潜在的ERE结合位点。结果:1.NOK蛋白在肺癌细胞中的表达主要位于细胞质内。在收集的191例肺癌组织标本中,NOK蛋白在肿瘤组织中的阳性率为75.4%(144/191),在癌旁组织中的阳性率为14.1%(27/191)。NOK的表达在肿瘤的不同病理分级(P=0.035)、淋巴结转移(P=0.005)、p TNM分期(P=0.020)及Ki-67指数(P=0.000)分组中具有显著的组间差异性;在不同性别(P=0.371)、年龄(P=0.470)、吸烟史(P=0.618)、组织学类型(P=0.332)及p T分期(P=0.525)分组中未见明显差异性。NOK蛋白表达阳性的144例肺癌患者中位生存时间为38月(95%confidence interval[CI]=26-50月),平均生存时间为34月(95%CI=30-39月);NOK蛋白阴性表达的47例肺癌患者平均生存时间为48月(95%CI=43-54月),中位生存时间无法求得,log-rank test统计结果显示NOK蛋白的表达对肺癌患者的生存情况有显著影响(P=0.004),NOK蛋白阳性表达的肺癌患者生存时间缩短。在鳞癌患者中,NOK蛋白阳性表达的肺癌患者较NOK蛋白阴性表达的患者生存时间更短(P=0.022)。在腺癌患者中,NOK蛋白阳性表达的肺癌患者与NOK蛋白阴性表达的患者生存时间之间无明显差异(P=0.054)。在p TNM I/II期肺癌患者中,NOK蛋白阴性表达的患者生存时间与阳性表达患者之间无明显差异(P=0.061)。在p TNM III/IV分期的肺癌患者中,NOK蛋白阴性表达的患者生存时间与阳性表达患者之间无明显差异(P=0.144)。Cox风险比例模型的单因素和多因素分析结果显示,NOK蛋白的表达是影响肺癌患者预后的独立危险因素之一。2.基因测序,q RT-PCR及Western Blot实验验证NOK过/低表达细胞系构建成功。细胞划痕实验及Transwell小室迁移结果显示过表达NOK基因的肺癌细胞系迁移能力增强,低表达NOK基因的肺癌细胞系迁移能力减弱。Transwell小室侵袭实验结果显示过表达NOK基因的肺癌细胞侵袭能力增强,低表达NOK基因的肺癌细胞侵袭能力减弱。3.q RT-PCR及Western Blot实验结果显示:在过表达NOK基因的肺癌细胞系中,EMT标志物E-cadherin的基因和蛋白表达水平降低、Vimentin基因和蛋白表达水平升高;在低表达NOK基因的肺癌细胞系中,EMT标志物E-cadherin的基因和蛋白表达水平升高、Vimentin基因和蛋白表达水平降低。4.在H520细胞中加入雌激素后,NOK基因的表达水平逐渐升高,在12h时达到峰值;在Calu-1细胞中加入雌激素后,NOK基因的表达水平则逐渐降低,12h后逐步回升。生物信息学分析结果显示:在距离NOK转录起始位点-1051bp,-1781bp,-2410bp存在着3个潜在的雌激素应答原件。结论:1.通过临床研究,我们发现NOK在肺癌组织中有较高的阳性表达率,其表达和肺癌患者的淋巴结转移、p TNM分期等临床要素相关,是影响肺癌患者预后的独立危险因素之一。2.在细胞功能学实验中,我们进一步证实NOK可以促进肺癌细胞的迁移和侵袭,同时其表达变化能够影响肺癌细胞的EMT过程。3.我们首次发现雌激素在肺癌细胞中能够调节NOK基因的表达,这可能是雌激素参与肺癌转移的机制之一。由此我们首次提出了雌激素-NOK-EMT-肺癌转移的新的潜在肺癌致病机制,有望为肺癌转移的治疗提供一个新的思路。