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研究背景随着人口老龄化的不断加速发展,神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)已在全球范围内广泛流行,极大地增加了个人、家庭和社会等各方面的负担。此类疾病与脑部的低氧有着密切的联系,脑组织对低氧的耐受性差,短时间的脑血液供应不足或中断会影响大脑正常的生理活动;而长期的脑供血不足则会引起脑中神经细胞的损伤及死亡。脑供血不足所致低氧能够引起一系列microRNA表达的变化,microRNA主要通过调节特异性m RNA靶标活性,以复杂网络调控的方式参与生物体生理进程,若microRNA生成或其功能通路发生障碍,将会导致复杂的级联反应,导致由生理到病理的恶性转变,甚至会影响一些疾病病程的启动。同时低氧会诱导细胞产生自噬,自噬对细胞生存、分化生长及内环境稳态都至关重要,保障蛋白质合成及降解处于动态平衡中,调节、防御细胞的应激,进而维持细胞的正常功能。本研究旨在研究低氧环境下microRNA通过调控靶基因对脑部小胶质细胞自噬的影响,为预防和治疗神经退行性疾病提供理论依据。研究目的探讨低氧环境下miR-392调控mTOR对小胶质细胞(BV-2)自噬的影响。研究方法将小胶质细胞分为正常组(21%O2)和低氧组(1%O2),通过高通量测序技术筛选正常与低氧环境下差异明显的microRNA,采用Target Scan、miRBase靶基因预测软件筛选出与自噬相关的差异microRNA的靶基因。采用q PCR和Western Blot实验检测正常、低氧环境下差异microRNA的表达,使用microRNA的mimics与inhibitor后,观测靶基因和自噬相关蛋白LC3的表达情况。研究结果通过高通量测序、靶基因预测技术及后期验证选定miR-392及靶基因mTOR进行自噬相关研究。细胞处于低氧环境的时间不同导致HIF-1α蛋白表达不同,18h后表达稳定,30 h后细胞不易存活。(1)与正常环境比较,低氧环境下miR-392的表达明显增强(0.99±0.01 vs.2.17±0.32,P<0.05);mTOR m RNA表达增强(0.97±0.03 vs.1.37±0.12,P<0.01)mTOR蛋白表达增强(1.03±0.78 vs.2.01±0.03,P<0.01)LC3的表达明显增强(0.99±0.01 vs.2.03±0.08,P<0.05)。(2)双荧光素酶实验结果显示miR-392直接靶向作用于mTOR,且是正向调控作用(8.15±0.55 vs.12.03±0.66,P<0.05)。(3)q PCR结果显示正常和低氧环境下miR-392 mimics组mTOR m RNA的表达量均高于对照组(0.97±0.03 vs.1.44±0.09,1.37±0.12 vs.2.36±0.17,P<0.05),miR-392 inhibitor组均低于对照组(0.97±0.03 vs 0.69±0.73,1.37±0.12 vs.1.08±0.01,P<0.05)。(4)mTOR的蛋白表达量Western Blot结果显示:在正常环境下miR-392 mimics组均高于对照组(1.03±0.78 vs.1.90±0.11,P<0.001);miR-392 inhibitor组均低于对照组(1.03±0.78 vs 0.56±0.06,P<0.05)。在低氧环境下miR-392 mimics组均高于对照组(2.01±0.03 vs.2.87±0.12,P<0.001);miR-392 inhibitor组均低于对照组(2.01±0.03vs.2.34±0.14,P<0.05)。(5)正常环境下miR-392 mimics组LC3的蛋白表达量高于对照组(0.97±0.03 vs.1.69±0.07,P<0.001),miR-392 inhibitor组低于对照组(0.97±0.03 vs 1.44±0.09,P<0.05);低氧环境下miR-392 mimics组LC3的蛋白表达量低于对照组(1.37±0.12vs.1.15±0.02,P<0.001),miR-392 inhibitor组高于对照组(1.37±0.12 vs.2.36±0.17,P<0.05)。(6)慢性低灌注小鼠组与对照组相比:小胶质细胞miR-392的表达明显上调(0.98±0.03vs.1.38±0.03,P<0.05)。研究结论低氧诱导microRNA-392表达上调,microRNA-392正向调控mTOR抑制小胶质细胞自噬。